第八章目的基因的表达详解演示文稿.pptVIP

宿主： 亮氨酸合成缺陷型酵母。 GAPD： 甘油醛磷酸脱氢酶 本文档共165页；当前第94页；编辑于星期六\11点51分 （2）表达分泌型蛋白 在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白质才能被糖基化。 需要糖基化的重组蛋白必须是分泌蛋白。 方法： 构建载体 在重组蛋白的前面加一段编码酵母菌交配类型因子a1的前导肽，与重组蛋白的N端通过Lys-Arg相连。 前导肽（leader peptide）： 本文档共165页；当前第95页；编辑于星期六\11点51分 蛋白质分泌到壁膜间隙时，酵母菌的内切蛋白酶识别这个切点信号，把重组蛋白正确切下来。 信号肽的切割： 前导肽 Lys-Arg 重组蛋白（水蛭素） 内切蛋白酶 本文档共165页；当前第96页；编辑于星期六\11点51分 6.其它酵母表达系统 （1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达 在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！ ①嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点 本文档共165页；当前第97页；编辑于星期六\11点51分 HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活调控）。 His4：组氨酸合成所需的组氨酸脱氢酶基因。 3’-aox1：整合到特定染色体的位点序列。 ②表达载体构建（整合型）： 诱导物：甲醇。 产量： 9×106剂疫苗/240L发酵罐。 本文档共165页；当前第98页；编辑于星期六\11点51分 整合到染色体中 本文档共165页；当前第99页；编辑于星期六\11点51分 （2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表达 作为饲料添加剂促进反刍动物消化。 产量：10L，200h连续发酵产出50g溶菌酶。 本文档共165页；当前第100页；编辑于星期六\11点51分 二、昆虫培养细胞表达系统 1. 杆状病毒（Baculovirus） 广泛侵染包括许多昆虫在内的无脊椎动物。 （1）侵染周期： 两种形式 ①单独病毒粒子形式 病毒 粒子 宿主细胞 病毒 粒子 侵染 释放 本文档共165页；当前第101页；编辑于星期六\11点51分 病毒 粒子 宿主细胞 侵染 宿主细胞 侵染 合成多角体蛋白 裂解 释放 多面体溶解 一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV） ②多面体形式 本文档共165页；当前第102页；编辑于星期六\11点51分 （2）杆状病毒的表达特点 ①感染后36-48h，病毒开始合成大量的 多角蛋白。 ②多角蛋白的启动子特别强。 ③多角蛋白基因可以被替换掉而不影响 病毒的繁殖。 本文档共165页；当前第103页；编辑于星期六\11点51分 多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。 3. 转化子筛选 通过显微镜检查看是否有多面体形成。 源自草地夜蛾的细胞株，在这种细胞中，多角蛋白的启动子特别活跃。 2. 最普遍应用的宿主细胞株 本文档共165页；当前第104页；编辑于星期六\11点51分 （1）转移载体的构建 大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组。 4. 杆状病毒转化载体 杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。 必须使用同源重组的办法。 多角蛋白的启动子和终止子及polyA加尾信号。 启动子与终止子之间插入多克隆位点 本文档共165页；当前第105页；编辑于星期六\11点51分 转移载体 本文档共165页；当前第106页；编辑于星期六\11点51分 （2）杆状病毒载体转化过程 ① 转移载体中插入外源基因 ② 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 ③ 转移载体与病毒基因组发生双交换 ④ 外源基因被交换转入病毒基因组中 ⑤ 重组病毒侵染宿主4-5天后即可收获重组蛋白。 本文档共165页；当前第107页；编辑于星期六\11点51分 本文档共165页；当前第108页；编辑于星期六\11点51分 4.目前已经用杆状病毒在真核生物细胞中表达的外源蛋白 本文档共165页；当前第109页；编辑于星期六\11点51分 5. 杆状病毒大规模表达存在的问题 杆状病毒侵染昆虫幼虫，在幼虫体内表达外源蛋白，成为“低成本蛋白工厂”。 22只粉蚊夜蛾幼虫4天后表达的人腺苷酸脱氢酶占幼虫总蛋白的2%-5%。共产出9mg很纯的产物。 （1）寿命短 感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡。 （2）共同转染率低 重组率更低。0.1%-1%。 本文档共165页；当前第110页；编辑于星期六\11点