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基于代谢组学的脾虚大鼠血清和尿液代谢表型研究
脾虚证是一种综合的病理变化,主要是由于食欲不振功能低下、多器官和系统功能低下而减少的。有人对脾虚证本质进行研究,结果显示脾虚证状态下唾液淀粉酶活性比值和D-木糖排泄率等显著降低、胃肠激素和脑肠肽调节异常等。建立中医证候动物模型是进行证候本质研究和相关中药药效研究的必要环节。脾虚动物模型的制作方法主要包括模拟中医传统病因和用西医病因病理研制等两大类。目前国内大部分研究还是采用症状、体征的定性法来衡量模型是否成立,且证候模型的指标往往局限于从一个或几个证候本身所表现出的现象中去选择,忽略了疾病对机体整体的影响,这样选择的指标不能全面地反映机体疾病的状态。
代谢组学的定义为:对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态多参数代谢应答的定量测定。从整体观念来看,证候是由外源性刺激(外邪)或基因变异(内因)所致的病理变化过程,该过程使生物代谢网络和细胞产生的内源性产物的种类、浓度、相对比例发生扰动,这种扰动体现在小分子代谢产物集合轮廓的改变。代谢组所反映的是人体生化网络对所有扰动因素进行应答和变化的终端信息,与中医“证”的内涵比较接近,为揭开“证”的面纱提供了契机。罗和古等对慢性束缚应激大鼠(肝郁脾虚模型)的血浆代谢表型改变进行了研究。本研究首次采用基于核磁共振技术(NMR)的代谢组学方法探讨了利血平所致脾虚大鼠血清和尿液代谢表型的变化,鉴定与脾虚相关的代谢标志物以探讨脾虚相关代谢途径。
1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性SD大鼠,160~180 g,购自广东省医学实验动物中心,合格证号:SCXK(粤)2008-0002。
1.2 数字化超压仪
Bruker AVANCE III 500 MHz全数字化超导核磁共振谱仪,瑞士Bruker公司;利血平注射液,广东邦民制药有限公司,批号:110719;叠氮钠(Na N3)、氘水(D2O),美国Sigma公司。
1.3 造模过程与培养
雄性SD大鼠12只置于室温22℃,湿度50%,12 h光照和12 h黑暗环境下自由饮食。适应3 d后,随机分为2组:对照组和模型组。模型组大鼠每天皮下注射利血平注射液(0.5mg·kg-1)连续15 d,对照组大鼠给予等体积的生理盐水。在造模过程中大鼠出现体质量减轻、食量减少、皮毛枯槁、失去光泽、行动迟缓无力、嗜睡、便溏、挤堆、拱背等症状。在造模第15天收集24 h尿液,尿液收集时,大鼠置于代谢笼中,代谢笼集尿器置于冰上,加入0.5 m L 2%Na N3溶液做防腐剂,收集的尿液置于-20℃冰箱中保存备用。尿液收集完成后,于大鼠眼眶后静脉丛取血3 m L,收集的血液样品经凝固(4℃,60 min)后离心(3500 r·min-1,15min,4℃)得到血清,置于-20℃冰箱中保存备用。
1.6 数据分析方法
在δ0.5~9.5区域按δ0.02等间隔分段积分,然后将所得数据转换成ASCⅡ文件输出到Excel 2007(Microsoft Inc.,Bellevue,WA)中进行下一步处理。对于血清和尿液样品,分别将区域δ4.68~5.22和δ4.48~5.98设为0积分段。在进行模式识别分析之前对各分段积分值进行归一化处理,所得数据乘以10 000后导入SIMCA-P 12.0(Umetrics AB,Umea,Sweden),经Pareto标度化预处理后,进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)。运用PASW 18.0(SPSS Inc.,Chicago,IL)对代谢物相对含量的组间差异进行t检验。
2 结果
2.1 代谢产物的提取
大鼠血清和尿液的1H-NMR谱如图1和2所示。代谢物谱峰的归属主要是依据化学位移值、峰的裂分情况、耦合常数及参考文献报导。血清中的代谢物除了脂蛋白和脂类外,还有糖类、氨基酸类、有机酸类和酮体等物质。尿液中的代谢物主要是氨基酸类、有机酸类和酮体等物质。
2.2 倍交叉验证法验证opls-da模型
本文使用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)研究对照组和模型组大鼠的代谢物谱差异。如图3所示,对照组和模型组的血清和尿液样本点在PC1维可以完全区分开,说明脾虚状态下大鼠机体生理及物质代谢状况已经发生了明显的改变。为了验证OPLS-DA模型的可靠性,采用7倍交叉验证法对其进行验证,得到了OPLS-DA模型的主要参数。血清:R2X(cum)=0.773,R2Y(cum)=0.972,Q2(cum)=0.942;尿液:R2X(cum)=0.711,R2Y(cum)=0.988,Q2(cum)=0.966。可见,本文建立的模型可靠性较高。
2.3 潜在的生物标志物评价
本文使用OPLS-DA模型中变量重要性投影(Variable importance in the projection,V
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