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复方山楂提取物的分离纯化工艺研究 复方山楂提取物系以黑加仑、山楂、腹泻、荷叶、蒲黄、明代六味中药汤、水提取物为基础，具有活血化瘀、肝肾活血的功效。该提取物中含有黄酮类、蒽醌类、生物碱类成分, 其中黄酮类化合物为主要药效成分, 主要来源于山楂、蒲黄、荷叶。山楂黄酮通过增强低密度脂蛋白受体活性和提高抗氧化能力, 抑制血清总胆固醇、低密度脂蛋白-胆固醇、APoB水平升高和防止高密度脂蛋白及APoAl水平下降, 从而预防脂质代谢紊乱及增强体内胆固醇清除。蒲黄黄酮是通过提高tPA活性、保护EC、抑制外源性胆固醇吸收等多种途径降低胆固醇和抗动脉粥样硬化。荷叶黄酮可明显降低血清胆固醇及甘油三酯。聚酰胺树脂是由酰胺聚合而成的一类高分子物质, 它对黄酮类化合物有较强的吸附性能, 主要通过氢键和范德华力吸附。本实验研究了复方山楂提取物中总黄酮在聚酰胺树脂上的吸附特性, 包括影响吸附量的单因素试验、静态吸附速率、静态解吸率和动态吸附、动态解吸率等。 1 药品、化学品和仪器 TU—1900 双光束紫外可见分光光度计, 北京普析通用公司;Büchi R201 旋转蒸发仪;BS210S电子天平, 德国赛多利斯;Alpha1—2冷冻干燥机, 德国Christ公司。 复方山楂提取物, 自制;芦丁对照品, 批号0080-9705, 中国药品生物制品检定所;聚酰胺树脂 (14～30目) , 色谱用, 上海医药 (集团) 上海化学试剂公司;试剂均为分析纯, 天津大学科威公司。 2 方法和结果 2.1 树脂体积个数的制备 取聚酰胺树脂装入色谱柱中, 用丙酮以0.3 BV/h (树脂体积倍数) 冲洗至洗出液无色, 最后用5倍柱体积的95%乙醇冲洗, 流速0.3 BV/h, 倒出, 置于烘箱中90 ℃烘干, 备用。 2.2 生药质量浓度 按处方量称取6味中药材, 加水浸泡8 h, 煎煮30 min, 滤过, 再加水, 煎煮30 min, 滤过, 合并滤液, 浓缩, 然后加乙醇, 充分搅拌, 静置24 h, 滤过, 滤液浓缩至无乙醇味, 加水溶解, 得到相当生药质量浓度为0.255 g/mL溶液。 2.3 黄酮的总测定 2.3.1 %乙醇法 精密称取干燥恒重的芦丁对照品13.0 mg, 置50 mL量瓶中, 加60%乙醇至刻度, 定容, 摇匀, 即得, 备用。精密吸取对照品溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2 mL, 分别置10 mL量瓶中, 分别加60%乙醇溶液至5 mL, 精密加入5%亚硝酸钠0.3 mL, 摇匀, 放置6 min, 再精密加入10%三氯化铝溶液0.3mL, 摇匀, 放置10 min, 再加入4%氢氧化钠溶液4 mL, 分别用60%乙醇定容至刻度, 摇匀, 置比色皿中, 以空白溶液作对照, 在510 nm处测吸光度 (A) 值。以质量浓度 (C) 对A绘制标准曲线, 计算得回归方程C=0.086 7A-0.003,r=0.999 8 。结果表明, 芦丁在0.010 4～0.083 2 mg/mL与吸光度呈良好线性关系。 2.3.2 样品测定 取供试品溶液, 按标准曲线的绘制项下方法测定各样品溶液的吸光度值, 测定3次, 取平均值, 根据回归方程计算得总黄酮的质量浓度。 2.4 聚吡咯树脂静态吸附和洗脱 2.4.1 附振摇时间 室温 (16℃) 下, 准确称取干燥的聚酰胺树脂0.250 g置具塞试管中, 加水浸泡树脂4 h, 使其吸水饱和, 滤掉多余水, 然后分别加入含生药量为0.025 5、0.051、0.102、0.153、0.204、0.255、0.357 g/mL的吸附液10 mL, 吸附24 h, 期间每隔一段时间振摇一次, 使其充分平衡。测定平衡液中总黄酮的质量浓度, 并计算相应吸附量 (Q) , 得到吸附量与总黄酮质量浓度的吸附等温曲线见图1, 以lnQ对lnC作图得到Freundlich曲线见图1。 Q= (C0—Ce)V/W Q为吸附量 (mg/g) ,C0为吸附起始质量浓度 (mg/mL) ,Ce为吸附平衡质量浓度 (mg/mL) ,V为吸附液体积 (mL) ,W为树脂质量 (g) 由吸附等温线可知, 聚酰胺树脂吸附总黄酮表现为优惠吸附, 吸附过程符合Freundlich吸附等温式, 其回归方程为lnQ=0.600 33 lnC+0.466 25,r=0.999 3;即满足Q=KC1/n, 其中常数1/n=0.600 33,K=1.594。K值粗略表示吸附能力的大小, 1/n值粗略表示吸附强度的大小。说明聚酰胺树脂对山楂提取物总黄酮有良好的吸附性能, 吸附能力大, 吸附强度小, 易解吸。 2.4.2 ph值的测定方法 黄酮类化合物为多羟基酚类, 呈弱酸性, 因此要找出吸附的最佳条件, 有必要考察