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水稻激发子活性物质分离及生物活性测定

由于水稻白叶枯病（xykoma）引起的水稻白叶枯萎是水稻科的一种重要细菌，也是世界上水稻种植地区的一种。在亚洲的一些地区,水稻白叶枯病造成减产可达50%以上。激发子是引发寄主防卫反应的因子,它与植物抗病性及诱导抗病性有关。人们把对病原物激发子的研究作为探索植物抗病性及诱导抗病性机制的一种重要研究策略,在一些病害中已有很多研究。有关水稻白叶枯病激发子已报道的有harpin蛋白,可以诱导广谱抗病性,但harpin蛋白多数在细胞内。本研究从水稻白叶枯病菌培养滤液中提取的外泌蛋白,检测具有激发子活性。通过等电聚焦电泳(RPIE)和离子交换层析(FPLC)纯化激发子。

1材料和方法

1.1试验中的蘑菇

JXOⅢ菌株为日本系统3号小种,是本研究室保存的实验菌株,它与水稻品种IR26为亲和反应。

1.2上清液和2so4沉淀液的制备

参照吴健胜蛋白提取方法并有所改进。将菌体接种于Watanabe液体培养基中,28℃振荡培养96h,离心取上清。上清液通过细菌滤器(0.45μm)抽滤,滤液用30%、40%、50%、60%、70%和80%饱和度的(NH4)2SO4分步饱和沉淀,离心沉淀用1mol/LTris-HCl(pH8.0)溶解,透析48h。透析袋内液即为外泌蛋白,冷冻真空抽干备用。

1.3外源性蛋白质激发子活性

1.3.1外泌蛋白接种对jxo菌体和水的影响

将JXOⅢ菌株培养至对数生长期,离心收集菌体。处理1:称10mg湿菌体用灭菌水稀释至2ml,加入已提取的JXOⅢ外泌蛋白,使蛋白的终浓度为10μg/ml,剪叶接种IR26;处理2:外泌蛋白稀释液(10μg/ml)均匀喷洒于IR26水稻叶片表面,1h后用剪叶接种法接种JXOⅢ。设JXOⅢ菌体、外泌蛋白和水为对照。水稻叶片按不同处理时间(0、24、48、72和96h)取样,每个样品约1g,重复3次,置-70℃冰箱待测。PAL酶活性测定参照文献。

1.3.2通过测定水稻叶片氧化酶po的活性

按1.3.1方法处理水稻和取样,PO酶活性测定参照文献。

1.3.3外排水蛋白田里的防效试验

按1.3.1方法处理水稻,每个处理5株水稻,重复3次。两周后观察田间病害发生情况,测量叶片病斑长度。

1.4外源性蛋白质激发子的纯度

1.4.1生物活性

取外泌粗蛋白5ml加入2.5ml两性电解质Amphorline(pH3.5~10,Amashia)于滚动式等电聚焦电泳仪(Bio-Rad)内,12W恒功率聚焦5~6h,减压收集样品,测定pH值,透析后测定生物活性。

1.4.2q-近自然平衡的q-近离子交换层析

经RPIE分离获得的活性组分,加入终浓度为10mmol/LKH2PO4-NaOH缓冲液(pH6.0),并以上述缓冲液为平衡液,进行Q-SepharoseFF.离子交换层析(FPLC,Phamacia),平衡液加2mol/LNaCl为洗脱液。收集洗脱峰,脱盐后测定生物活性。

1.5外排蛋白质sds

将上述活性峰按Laemmili的方法进行SDS电泳,分离胶浓度为12.5%,200V恒压电泳6h。

2结果与分析

2.1接种jxo后pal活性的变化

从图1可以看出,蛋白处理后的PAL活性在24、48h明显上升,且高于直接接种JXOⅢ和水对照,48h以后开始下降。先喷雾蛋白后接种JXOⅢ,PAL活性在0至24h呈上升趋势,48h略有下降,72h活性达到最高,以后又开始下降。蛋白与JXOⅢ菌体混合接种PAL活性变化趋势类似于蛋白单独处理。

2.2对ir6叶片po活性的影响

在JXOⅢ与蛋白混合接种和先喷蛋白后接种JXOⅢ的两个处理中,IR26叶片PO活性一直呈上升趋势,且明显高于对照。单独用蛋白处理的PO活性变化与对照差别不大(图2)。

2.3外泌蛋白对水稻白叶枯病斑的防治作用

将外泌蛋白喷于水稻叶片,再用剪叶法接种水稻白叶枯病菌JXOⅢ,在14、21和28d时,与直接接种JXOⅢ相比,病斑长度差异显著,相对抑制效果分别为63.59%、70.80%和42.77%;而外泌蛋白和JXOⅢ混合后再用剪叶法处理水稻,在14、21和28d时,与直接接种JXOⅢ相比,病斑长度差异极显著,并且在14d后,对水稻白叶枯病斑的相对抑制效果为86.84%,随着水稻生长至28d,抑制效果仍达72.78%,在田间防效上显著高于直接喷雾效果(表)。由此可见,外泌蛋白对水稻白叶枯病具有较好的抑制作用。邵敏等研究曾发现外泌蛋白具有解毒活性,处理毒素可以有效地解除毒素对水稻出苗的抑制作用。当外泌蛋白与病原菌混合接种后,与病菌直接接触,既发挥了其解毒作用消除了病原菌产生的致病毒素,又有激发子的功能,使病斑比先喷雾后接种抑制效果明显。

2.4激