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柱前衍生化高效液相色谱法分析茯苓多糖的单糖组成

椰子是一种传统的中医，具有健脾安神、利水补水的功效。茯苓多糖是茯苓干燥菌核基本组成部分,约占干重的93.0%,易溶于稀碱液而不溶于水。有文献报道其结构为带有β-(1→6)支链的β-(1→3)-D-葡聚糖。目前对茯苓多糖的研究主要集中在通过化学、物理学及生物学等手段对其进行结构修饰后用于抗肿瘤和免疫增强剂等方面。

多糖是广泛存在于自然界的天然高分子化合物,由单糖通过糖苷键连接而成。多糖的单糖组成测定是控制多糖质量标准和提供多糖基本信息的最重要环节。单糖组成分析是糖分析的一项基础而重要的内容。由于多数糖类物质不具备光学性质,因此对糖类物质采用色谱或电泳方法进行分离测定时,常用紫外或荧光试剂对糖类物质进行衍生,以改善其光学活性,提高检测灵敏度。HONDA等首次将具有强紫外吸收的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)用于糖类物质的衍生,发现它能与还原性的糖在温和条件下反应,产物无立体异构体,且在245nm处有强吸收。

笔者采用PMP柱前衍生化,用常规的紫外检测器和C18烷基键合柱,建立了测定茯苓多糖单糖组成的灵敏、快速、准确、方便的高效液相色谱(HPLC)新方法。

1材料和方法

1.1色谱柱及试剂

戴安公司Summit?HPLC系统(P680LPG型低压四元梯度泵;ASI-100自动进样器;TCC-100柱温箱;PDA-100二极管阵列检测器;CHROMELEONTM色谱信息管理软件);C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm,DikmaTechnologies)。

衍生化试剂PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮化学纯,国药集团化学试剂有限公司);三氟乙酸(TFA,化学纯,上海化学试剂公司);单糖对照品:葡萄糖(99.8%,Amresco),甘露糖(99%,Sigma),半乳糖(99%,Sigma),鼠李糖(99%,Sigma),葡萄糖醛酸(98%,上海化学试剂二厂),阿拉伯糖(99.8%,Sigma);乙睛和甲醇均为色谱纯,其他试剂均为分析纯。

1.2茯苓多糖的制备

取过孔径0.25mm(60目)筛的茯苓粉末,溶于3℃的0.5mol·L-1氢氧化钠溶液中,搅拌至粉末溶解,此时溶液呈粘稠状态。5℃以下冷藏,过夜,抽渣弃去,滤液以10%醋酸液中和至酸性,再加入等量95%乙醇,于3℃放置过夜,滤取沉淀,依次用纯化水、无水乙醇、丙酮洗涤后,减压抽干,置干燥箱中60℃以下干燥,即得茯苓多糖粗品,呈白色粉末。称取茯苓多糖粗品5.00g,溶于二甲亚砜(DMSO)中,在室温下搅拌数小时后,加入纯化水,继续搅拌,放置,抽滤。沉淀用无水乙醇、丙酮洗涤,置干燥箱中干燥,即可得茯苓多糖精制品。

1.3ph的调ph

取茯苓多糖样品40mg于安瓿中,再加入4mol·L-1三氟乙酸溶液1mL,封管后于90℃水解8h,得水解样品溶液,转移至EP管中离心,取上清液用0.3mol·L-1氢氧化钠溶液调pH至中性。

1.4茯苓多糖水解法

分别称取半乳糖、葡萄糖和甘露糖各约0.018g,鼠李糖约0.016g,葡糖醛酸约0.019g,阿拉伯糖约0.015g溶于0.3mol·L-1氢氧化钠溶液1.0mL中,配制每种单糖的标准溶液(约为0.1mol·L-1),分别取每种单糖的标准溶液100μL混合,配制混和标准品溶液(每种单糖浓度约为1/60mol·L-1)。取标准品溶液或茯苓多糖水解溶液50μL于EP管中,依次加入PMP溶液(0.5mol·L-1甲醇溶液)50μL和0.3mol·L-1氢氧化钠溶液50μL,混匀后置于70℃水浴中加热反应30min。取出室温放置10min;再加入0.3mol·L-1盐酸溶液60μL中和至酸性,混匀后用0.5mL三氯甲烷萃取,涡旋3min,5000g离心15min,小心弃去有机层(下层),萃取3次,5000g离心15min,上清液加水至500μL混匀,用于HPLC分析。

1.5溶剂及检测波长

流动相:溶剂A,15%(V/V)乙腈+50mmol·L-1磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH,pH6.9);溶剂B,40%(V/V)乙腈+50mmol·L-1磷酸缓冲液(KH2PO4-NaOH,pH6.9),梯度模式:时间梯度为0,10,55min,相应浓度梯度为0%,10%,30%溶剂B流速:1.0mL·min-1;