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茯苓中多糖的提取及分离

作为一种传统的中药，它具有健脾、安神、补水、除湿等功效。其药用部位为茯苓菌核,含茯苓多糖约为93%。近几年有关文献报道茯苓多糖或经改造的茯苓异多糖具有促进细胞分裂、补体激活、抗肿瘤、抗癌等生物活性,因此提取茯苓多糖的研究成为一项很有意义的基础工作。本实验采用正交试验法优选传统的水煎煮、稀碱浸提工艺条件,以期获得更高提取率,优选出较优的工艺,并对多糖进行定量检测。

1设备、试剂和材料

721型分光光度计、真空抽滤装置;

茯苓(购自五块石药材市场);无水葡萄糖、苯酚、硫酸、氢氧化钠等均为AR级。

2实验方法

2.1水煮法提取茶多酚

2.1.1乙醇、丙酮、分离多糖提取

取60目茯苓和茯苓皮粉末10.0g各三份按水煎煮法操作:原料→水煎煮→抽滤→滤液过活性炭柱脱色→浓缩→乙醇沉淀→依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤→粗多糖。分别提取5次,每次1.5小时;醇沉浓度为80%。结果见图1,相同提取次数时,茯苓的多糖提取率始终高于茯苓皮,故选择茯苓做原料。

2.1.2考察因素及水平

称取茯苓粉末10.0g,常压下100ml水煎煮。安排L8(27)正交试验,以多糖含量为考察指标,每次实验重复一次。考察因素及水平见表1,结果见表2,由极差R分析知,A与B的交互作用的影响弱于A、B各自的影响,可不考虑其交互作用(A×B);同理也可不考虑A与C的交互作用(A×C)。最佳条件为A2B2C1D2E2。

2.1.3压力的影响

在有压力的条件下浸取,结果见图2,表明压力条件下2次的提取率与常压提取3次的提取率相近,故选择压力条件提取。

2.2碱性浸泡法提取茶多酚

2.2.1粗多糖的提取

取60目茯苓和茯苓皮粉末5.0g各三份,溶于低于5℃的0.5mol/lNaOH溶液中,搅拌至稠状,按如下过程操作:碱浸→抽滤→用10%醋酸中和滤液→低温放置过夜→抽滤→依次用水、乙醇、丙酮乙醚洗涤沉淀→低温干燥→粗多糖。浸提7小时,各3次。结果见图3,提取第二次后几乎无残渣供第三次提取,同上,该提取工艺也选择茯苓为原料。

2.2.2因素水平表1

称取茯苓粉末5.0g,用稀碱浸提,选用L8(3×24)因素水平(表3),结果见表4。由极差R分析可知,稀碱浸提的最佳条件为:提取2次,药品粒度为-80目,料液比为1∶100,提取7h。

2.3多酚测定

2.3.1标准曲线

2.3.1.浓硫酸、浓硫酸、总氮的含量测定

精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖60mg,配制成100ml水溶液。精密吸取该溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml分别置于50ml容量瓶,定容。精密吸取上述各浓度的标准溶液2.0ml,加1.0ml苯酚,混匀,迅速加入浓硫酸7.0ml,摇匀,于40℃水浴中保温30分钟后移至冰水中,放置30分钟后测定吸光度。结果见表5,由最小二乘法得回归方程#1:A=0.0976C-0.0003,r=0.9991,在12～72μg范围内呈良好的线性关系。

2.3.1.甲亚溶剂

精密称取105℃干燥恒重的葡萄糖120mg,将(1)项中水溶剂换为二甲亚砜溶剂,其他操作相同。得工作曲线的回归方程#2:A=0.0572C+0.0010,r=0.9991,在24～144μg范围内线性关系良好。

2.4氨基酸、蛋白质杂质

2.4.1茯苓粗多糖的定性检测:Molish反应均呈阳性,说明含多糖;茚三酮反应均呈阴性,说明两种提取方法所得多糖基本不含氨基酸、蛋白质杂质。即测定多糖含量时,不存在氨基酸、蛋白质的干扰。

2.4.2本实验所选二甲亚砜为溶剂测碱提的多糖,其吸收曲线走向与水溶剂基本一致,且最大吸收波长相同(见图4、图5);实验结果表明:在两种溶剂中糖醛衍生物3h内显色稳定,RSD分别为1.2%、1.3%。此外,两种溶剂中,回收率分别为101.7%和100.7%,结果满意。

3稀碱浸提法提取率

3.1通过优选工艺条件,水煎煮法和稀碱浸提法的提取率为0.829%、74.9%分别超过了文献值0.63%和71.3%。

3.2实验结果证明,稀碱浸提法比水煎煮法操作简单,提取率高。

3.3在多糖含量测定中,选择了适当的溶剂,解决了碱提茯苓多糖难于溶解的问题,便于直接进行分光光度法的测定。