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基于荧光素标记的阴离子葡聚糖靶向脂质体的制备

基因治疗作为一种有效的治疗方法，已应用于各种疾病的临床治疗。自1990年以来就开始了通过病毒或非病毒载体介导的基因治疗。在非病毒载体中,阳离子脂质体介导的基因传递系统是最有前景的传递系统之一。

叶酸是细胞(尤其是增生细胞)所必需的维生素,参与多种代谢途径的一碳转移反应。叶酸的细胞转运通过两种跨膜蛋白,即低亲和力的还原性叶酸载体和高亲和力的叶酸受体(folatereceptor,FR)来完成。目前已证实FR在多种肿瘤细胞表面过度表达,而在多数正常组织中的表达仅限于一些难于进入血液循环的上皮细胞顶膜。正因为FR表达的特性,FR天然配体——叶酸成为将药物靶向到肿瘤细胞的重要分子,叶酸具有与叶酸受体的高亲和力(Kd=1×10-10mol·L-1)、低免疫原性、易于修饰、体积小(MW=441.4)、高度化学稳定性和生物学稳定性,高的肿瘤渗透性、易与药物结合,与有机和水性溶剂的相容性以及低成本等优点,使叶酸介导肿瘤靶向的研究得到迅速发展。

为此,研究能够靶向作用于肿瘤细胞且具有较高转染率的基因载体,有利于提高基因治疗效果。作者选择叶酸修饰阳离子脂质体以提高脂质体的靶向选择性,合成了靶向脂材F-PEG-DSPE,以DFA为模型物质,制备高包封率的叶酸阳离子脂质体,考察其药剂学性质,并分别用细胞表面高表达叶酸受体的鼻咽癌细胞(KB)和低表达叶酸受体的肝癌细胞(HepG2)进行了细胞摄取作用评价。

细胞、细胞培养和dfa的检测

试剂和药品DC-Chol(本实验室合成);二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC,NOFCo.,Ltd.);二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(distearoylphosphatidylethanolamine,DSPE,NorthernLipidsCo.,Ltd.);聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺[polyethyleneglycol(MW=2000)-distearoylpho￣sphatidylethanolamine,PEG-DSPE,NorthernLipidsCo.,Ltd.];阴离子葡聚糖(dextranfluoresceinanionic,DFA,MW≈3000,Invitrogen);葡聚糖G-50(Pharmasia,USA),NH2-PEG-NH2(MW≈3350,Sigma),N,N′-二环己基碳化二亚胺(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide,DCC,Sigma),N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS,AdvancedChemTech),琥珀酸酐(succinicanhydride,SUC,北京金龙化学试剂有限公司),四唑盐(MTT,Sigma),叶酸(folate,folicacid,F,国药集团化学试剂有限公司),其他试剂均为分析纯。

细胞HepG2细胞株和KB细胞株由北京大学国家肿瘤药物筛选中心提供。细胞常规培养于37℃、5%CO2,含10%胎牛血清,青霉素、链霉素各100μg·mL-1的RPMI-1640培养液中。每2~3d经2.5g·L-1的胰酶EDTA消化,传代培养。

DFA的性质考察分别在去离子水,0.9%NaCl,5%葡萄糖溶液,pH7.0的磷酸盐缓冲液(phosphatesalinebuffer,PBS)用荧光分光光度计(RF-5301PC,日本岛津制作所)扫描DFA的最大激发波长和最大发射波长。另取适量的DFA分别溶于pH为7.0、7.4、8.0和9.0的PBS,扫描荧光最大激发和发射波长,并测定荧光强度。

DFA的标准曲线精密称取DFA标准品适量,用PBS配成浓度为100μg·mL-1的贮备液。精密吸取DFA贮备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6mL,置于100mL量瓶中,加PBS至刻度配成浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6μg·mL-1的标准溶液,在其最大激发波长494nm和发射波长514nm处测量DFA的荧光吸收强度,以DFA的浓度(C,μg·mL-1)对吸收度进行线性回归。重复操作3次,连续测定3d,并计算日内精密度和日间精密度。

F-PEG-DSPE的合成①N-琥珀酰-DSPE的合成。DSPE100mg和SUC14.7mg在含有10μL吡啶的氯仿5mL中反应过夜。加入冷丙酮沉淀产物并重复1~2次,硅胶柱分离纯化产物。②F-PEG的合成。F500mg溶解于10mL二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO),加入NHS286.8mg,DCC257.1mg和三乙胺0.25mL,避