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加压毛细管电色谱在中药黄柏指纹图谱中的应用

1高效分离技术

近年来，提出了一种新的微分离技术。这是在毛细管柱内填充固定相和管壁连接固定相，并以连续床的形式填充在电渗流的驱动下，样品可以根据固定相和流动相中的不同分配系数以及不同的电渗流分离。cec结合高效液相色谱法（hplc）和毛细管电泳（ce）的特点。具有高柱效、快速分离、高选择性、高精度和样品体积小等优点。然而，简单的cec模型容易产生泡沫和干柱等问题。采用压力导向的高效液相色谱法（pcec）与电渗流和压力相联合驱动流动相，可以很好地解决上述问题，并消除梯度清洗。这是电铬研究领域的一个前沿技术。

中药由于组成复杂,高效分离是研究其药效物质基础至关重要的一步,近年将CEC这种高效分离技术用于中药分离逐渐广泛,而且这些研究也显示出了CEC在中药分析中的优越性.比如刘海兴等使用开管毛细管电色谱分别测定了旱莲、槐花、槐角中总黄酮的含量,为药物中黄酮类有效成分的测定开拓了一种分离效率更高的新方法;谢国祥等用pCEC发现西藏红花和普通红花中组分的细微差别,为全面客观地评价这两种中药材提供了依据.

黄柏是芸香科黄柏属植物黄皮树(川黄柏)或黄檗(关黄柏)的干燥树皮,具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效.黄柏中主要含小檗碱、木兰碱、黄柏碱、巴马汀、药根碱等多种生物碱及内酯、甾醇、黏液质等成分.众所周知,中药指纹图谱是目前国际上公认的中药质量评价体系之一,多采用HPLC作为测定标准.唐艳梅等也利用HPLC的方法对黄柏中的有效成分和指纹图谱进行了研究[7~9].建立指纹图谱的原则是要求其方法具有系统性、特征性和重现性.pCEC作为一种新型的高效分离技术,满足中药指纹图谱分离的需要,在中药指纹图谱的研究具用很好的应用前景.在本研究中以pCEC为平台,针对黄柏中所含组分的特点,开展了pCEC在建立黄柏指纹图谱中的方法学研究.并比较了微径液相色谱(μ-HPLC)和pCEC两种不同分离模式得到的黄柏指纹图谱的区别,说明μ-HPLC和pCEC各自的分离特点.

2实验部分

2.1仪器和检测柱

TriSepTM-2100加压毛细管电色谱仪(UnimicroTechnologies,Inc.,Pleasanton,CA,USA)包括2台高压输液泵和溶剂梯度洗脱系统、纳升级定量进样阀、UV/VIS柱上检测器、双模式高压电源和数据采集分析系统和C18毛细管色谱柱(苏州环球色谱公司);KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BT224S电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司);0.22μm微孔滤膜(醋酸纤维素膜,上海亚东核级树脂有限公司);50μmi.d.熔融石英毛细管柱(河北永年锐沣色谱器件公司).

乙腈、甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司);水为娃哈哈纯净水;氯化铵、盐酸为分析纯(国药集团).

黄柏样品购于上海雷允上药店,盐酸小檗碱(110713-200609)、盐酸巴马汀(110732200506)、盐酸药根碱(0733-200005)购自中国药品生物制品检定所.

2.2样品溶液的制备

2.2.1对照溶液的制备

分别称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱适量,溶于甲醇中即得,备用.

2.2.2提取溶剂的制备

取黄柏粉末0.1g,置于10mL容量瓶中,加入10mL提取溶剂提取过夜,再超声30min,经0.22μm滤膜过滤即得,备用.

2.3l-乙腈,b为10mm的透照溶液

色谱柱:50cm(有效长度25cm)×150μmi.d.,5μm,C18.流动相:A:20mmol/LNH4Cl溶液-乙腈(95:5),B:20mmol/LNH4Cl溶液-乙腈(5:95),洗脱梯度:0~5min,0%~5%B;5~30min,5%~20%B;30~40min,20%~35%B;40~55min,35%~50%B;55~65min,50%~80%B.检测波长:230nm.柱上线性流速:1.3mm/s.分流比:500︰1.进样量:1μL

3结果与讨论

3.1提取溶剂的选择

黄柏中含有较多生物碱和内酯、甾醇类物质,一般使用有机溶剂提取能得到较多的提取物.本实验中共考察了三种提取溶剂:95%乙腈溶液、甲醇-盐酸(99︰1,V/V)溶液和纯甲醇溶液的提取效果,发现甲醇-盐酸溶液提取后色谱峰的数量明显多于其他两种提取溶液提取的效果,故选用其作为提取溶剂.

3.2流动相nh4cl

首先对流动相中有机溶剂的种类和浓度进行了考察.实验中所用流动相A为20mmol/LNH4Cl-有机溶剂(95︰5,V/V),B为20mmol/LNH4Cl-有机溶剂(5︰95,V/V).考察了五种有机溶剂对分离的影响:甲醇、甲醇-乙腈(75︰25)、甲醇-乙腈(5