《食用油中黄曲霉毒素B1的测定 时间分辨荧光免疫层析法》征求意见稿.docx

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食用油中黄曲霉毒素B1的测定时间分辨荧光免疫层析法

1范围

本文件描述了时间分辨荧光免疫层析法测定食用油中黄曲霉毒素B1方法。本文件适用于大豆油、菜籽油、花生油等食用油中黄曲霉毒素B1的测定。本文件黄曲霉毒素B1的检出限为1.0μg/kg。方法定量范围为1-25μg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中黄曲霉毒素B1与铕乳胶标记的特异性抗体发生结合后，抑制了层析过程中抗体与硝酸纤维素膜检测线上黄曲霉毒素B1-BSA偶联物的免疫反应，使检测线时间分辨荧光强度降低，通过检测时间分辨荧光强度变化进行定量测定。

5试剂

5.1水，按照GB/T6682中的要求，二级。

5.2乙醇（CH3CH2OH）。

5.3蔗糖（C12H22O11）。

5.4牛血清白蛋白（BSA）．纯度大于98%。

5.5吐温﹣20（C58H114O26）。

5.680%乙醇水溶液：取80mL乙醇（5.2），加入到20mL水（5.1）中，混匀。

5.7样品稀释液：取1.0g蔗糖（5.3）、0.5g牛血清白蛋白（5.4）和2.5g吐温﹣20（5.5），溶解于100.0mL水（5.1）中。

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5.8铕标记黄曲霉毒素B1抗体溶液：黄曲霉毒素B1抗体纯度80％以上，亲和力常数不

低于1.00根108L/mol。黄曲霉毒素B1抗体与黄曲霉毒素B2、黄曲霉素G1、黄曲霉素G2交叉反应率小于10%。

5.91000ng/mL黄曲霉毒素B1标准溶液。

5.10100ng/mL黄曲霉毒素B1标准储备液：准确吸取黄曲霉毒素标准溶液（5.9）1mL于10mL容量瓶中，甲醇定容。4℃可保存3个月。

警告———由于黄曲霉毒素毒性很强，试验人员应注意自我保护。操作时，应避免吸人、接触黄曲霉毒素标准溶液。标准溶液配置应在通风橱内进行，工作时应戴眼镜、穿工作服、戴医用乳胶手套。凡接触黄曲霉毒素的容器，需浸入10％次氯酸钠溶液12小时以上。同时为了降低接触黄曲霉毒素的机会，本标准鼓励直接购买并使用黄曲霉毒素的有证标准储备液。

6仪器与材料

6.1时间分辨荧光检测仪：激发波长（365±5）nm，检测波长（615±5）nm。

6.2黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析装置（图1）：固定有黄曲霉毒素一BSA偶联物。检测灵敏度不低于1.0μg/kg，用于样品中黄曲霉毒素与铕标记抗体预反应后再与黄曲霉毒素-BSA偶联物反应的载体。

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图1黄曲霉毒素B1免疫层析装置示意图

6.2.1黄曲霉毒素一BSA偶联率为1:5~1:20（BSA:AFB1）。

6.2.2样品垫：玻璃纤维、酯纤维或纸质薄片。

6.2.3硝酸纤维素膜：4cm毛细时间不小于135s。

6.2.4吸水纸。

6.2.5底板。

6.2.6连接胶带。

6.3离心机：4000r/min。

6.4分析天平：感量0.01g。

6.5恒温装置：温控范围为（37.0士2.0）℃。

6.6漩涡混匀仪。

6.7微量移液器：1μL~10μL，10μL~100μL，100μL~1000μL。

6.8手持读数仪。

6.9耗材：枪头、离心管、50mL量筒、计时器等。

6.10铕乳胶：荧光寿命≥600μLs。

7分析步骤

7.1准确称取1.0g食用油于10mL离心管中，加人1mL80%乙醇水（5.6），用漩涡混匀仪（6.6）提取1min，将震荡后的样本以4000r/min离心3min。

7.2将7.1中离心分层的提取液进行稀释。

7.2.1取100μL样本上清液加入到600μL样本稀释液（5.7）中，混匀。

7.2.2取7.2.1中100μL混合溶液加入到600μL样本稀释液（5.7）中，混匀即为待检液，

备用。

7.3取150μL铕标记黄曲霉毒素B1抗体溶液于微孔中，冻干备用。

7.4取稀释后的