高效液相色谱法原理与应用-.pptVIP

*封尾封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。由于硅烷相对很大的体积，使得C18和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的50%。硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。第128页,共136页，星期六，2024年，5月*理论塔板数N粒径(μm)柱长(cm)塔板数N10156,000-7,00010258,000-10,0005107,000-9,00051510,000-12,00052517,000-20,000356,000-7,00037.59,000-11,00031012,000-14,00031517,000-20,000色谱柱的柱效高意味着色谱柱装填得好第129页,共136页，星期六，2024年，5月*评价色谱柱好坏的标准1）理论塔板数N2）拖尾因子Tf3）色谱柱背压4)色谱柱批与批之间的重现性5）pH值的适用范围6）使用寿命第130页,共136页，星期六，2024年，5月*拖尾因子TfAs=1.0-1.05很好As=1.2一般As=2差As=4很差不对称因子和拖尾因子的关系As(at10%)Tf(at5%)1.01.01.31.21.61.41.91.62.21.82.52.0不对称因子(As)=BAA拖尾因子(Tf)=A+B2A10%峰高5%峰高第131页,共136页，星期六，2024年，5月*色谱柱背压粒径均一会使色谱柱的背压相对较低。色谱柱两端的压力降不应超过公式计算所得的30％。硅胶粒径对色谱柱的压力具有很大的影响；硅胶粒子越小，色谱柱的背压越大。色谱柱的背压还与流动相的粘度有关。P=3000Lηt0dp2P是色谱柱背压(psi)，L是色谱柱的长度(cm),η流动相的粘度(cP)，t0是色谱柱死时间,dp是粒子的直径(μm)第132页,共136页，星期六，2024年，5月*为什么色谱柱会失去作用?部分原因是色谱柱塞板或柱床被堵塞——导致色谱柱背压上升、峰形拖尾和柱效下降。吸附了样品杂质——导致柱效下降、选择性和保留时间改变。色谱柱没装填好——导致柱效下降和峰形拖尾。物理损伤或受热引起的缺口——导致柱效下降和峰形拖尾。对硅胶基质或键合相的化学腐蚀——导致选择性变弱、峰形拖尾、保留能力下降（或对碱性化合物的保留能力增强）。第133页,共136页，星期六，2024年，5月*现代高效液相色谱柱的要求超纯B型球形硅胶——峰形好、柱效高。不能有使色谱性能降低的直径小于50?的微孔。粒径尺寸从3μm到10μm——能满足从分析到制备色谱规模的需求。色谱柱柱床装填好——使用寿命长、柱效高。封尾彻底——峰形好、使用寿命长。批与批之间得重现性好。不同的相具有不同的选择性——能更好的实现分离。键合相化学稳定好——适用的pH范围广,使用寿命长。第134页,共136页，星期六，2024年，5月*为什么反相色谱应用如此广泛?它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。第135页,共136页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第136页,共136页，星期六，2024年，5月***方法研究

1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。第96页,共136页，星期六，2024年，5月*食品分析第97页,共136页，星期六，2024年，5月*第98页,共136页，星期六，2024年，5月*第9