第十节 谷胱甘肽过氧化物酶(gshp)活力测定.docx

血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定

原理

谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。

试剂和仪器

仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加

样器

试剂：叠氮钠磷酸缓冲液pH7.0

NN

a 3

EDTA-N

a2

NHPO

a2 4

NHPO

a 2 4

16.25mg

7.44mg1.732g

1.076g

终浓度2.5mmol/L终浓度0.2mmol/L终浓度0.2mol/L终浓度0.2mol/L

加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NOH调pH7.0，4℃保存。

a

1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液

GSH30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。

1.25－1.5mmol/LHO溶液

2 2

取30％HO 0.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临

2 2

用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。偏磷酸沉淀液

HPO

3

EDTA

NCl

a

16.7g（先用蒸馏水溶解）

0.5g

280g

加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。

0.32mol/LN

a2

HPO

4

溶液:

NHPO 22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。

a2 4

DTNB显色液

DTNB

柠檬酸三钠

40mg1.0g

加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。

0.2M磷酸缓冲液pH7.4

0.9%生理盐水

实验步骤

样品制备

溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h

内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。

组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）甘油分装于塑料管，放置-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。

GSH标准曲线的制作：

取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。

取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/LNaHPO2.5mL，比色前

2 4

加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。

以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线。

423

测定步骤：

试剂1.0mmol/LGSH样品**

双蒸水*

样品管（mL）

0.4

0.4

非酶管（mL）

0.4

0.4

空白管（mL）

HO（37℃预热）

2 2

37℃水浴预温5min

0.2 0.2

37℃水浴准确反应3min（严格控制时间）

偏磷酸沉淀液4

偏磷酸沉淀液

4

4

3000r/min离心10min

离心上清液双蒸水

2

2

0.4

偏磷酸沉淀液

1.6

0.32mol/LNHPO

2.5

2.5

2.5

DTNB显色液

0.5

0.5

0.5

显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。

*样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。

**溶血液 0.1－0.4mL

组织上清液 1:20稀释，取稀释液0.4mL

注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。

计算

鼠全血GSH-P