NYT 2678-2015 马铃薯6种病毒的检测 RT-PCR法.docxVIP

ICS65.020.01B15

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2678—2015

马铃薯6种病毒的检测RT-PCR法

Detectionofthesixpotatoviruses—RT-PCRmethod

2015-02-09发布2015-05-01实施

中华人民共和国农业部

发布

I

NY/T2678—2015

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。

本标准由农业部种植业管理司提出并归口。

本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨)、湖南农业大学园艺学

院、华中农业大学生命科学技术学院、福建农林大学。

本标准主要起草人：张威、白艳菊、李学湛、柳俊、詹家绥、聂碧华、胡新喜、何长征、高艳玲、范国权、申宇、张抒、王晓丹、王文重、魏琪、邱彩玲、耿宏伟、董学志、万书明。

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NY/T2678—2015

马铃薯6种病毒的检测RT-PCR法

1范围

本标准规定了马铃薯S病毒(PotatovirusS,PVS)、马铃薯X病毒(PotatovirusX,PVX)、马铃薯

M病毒(PotatovirusM,PVM)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potatoleaf-

rollvirus,PLRV)和马铃薯A病毒(PotatovirusA,PVA)的反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分子生物学检测方法(见附录A)。

本标准适用于马铃薯试管苗、原原种和田间马铃薯块茎、植株等组织中病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3原理

本标准采用反转录—聚合酶链式反应(reverse-transcriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)方法检测马铃薯病毒。其原理是，将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术，RNA在反转录酶的作用下反转录成cDNA,再以cDNA为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判断该样品中是否含有目的片段，从而达到鉴定病毒的目的。

4试剂和材料

以下所有试剂，除非另有规定仅使用分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水。

4.1TRIzolRNA提取试剂

4.2三氯甲烷4.3异丙醇

4.475%乙醇

量取无水乙醇75mL,加水定容至100mL。

4.5M-MLV反转录酶(200U/L)

4.6RNA酶抑制剂(40U/L)

4.7TaqDNA聚合酶(5U/L)

4.810×PCRbuffer(Mg2+free)

4.9MgCl?(25mmol/L)

4.10dNTP混合物(各2.5mmol/L)

4.11焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水

在100mL水中，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)50μL,室温过夜，121℃高温灭菌20min,分装到

1.5mLDEPC处理过的离心管中。

4.1210×TAE电泳缓冲液

羟基甲基氨基甲烷(Tris)242g,冰乙酸57.1mL,乙二胺四乙酸二钠·2H?O37.2g,用氢氧化钠调pH至8.5,加水定容至1000mL。

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4.131×TAE电泳缓冲液

量取10×TAE电泳缓冲液(4.12)100mL,加水定容至1000mL。

4.14溴化乙锭溶液(10mg/L)

称取溴化乙锭200mg,加水溶解，定容至20mL。

4.151.5%琼脂糖凝胶板

称取琼脂糖1.5g,加入1×TAE电泳缓冲液(4.13)定容至100mL,微波炉中加热至琼脂糖融化，待溶液冷却至50℃~60℃时，加溴化乙锭溶液(4.14)5μL,摇匀，倒入制胶板中均匀铺板，凝固后取下梳子，备用。

4.16引物缓冲液

用DEPC水将上、下游引物分别配制成浓度为100ng/pμL的水溶液。

4.17100bpDNA分子量标准物

4.18阳性对照

参见附录B中B.1。

4.19阴性对照

参见附录B中B.2。

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