湿式大肠菌群快检纸片性能验证的方法探索.docx

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湿式大肠菌群快检纸片性能验证的方法探索

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刘哲李丹妮王宇王涛王萌冯淑

摘要：目的：探索对市售湿式大肠菌群快检纸片性能进行分析、验证的一般流程，为检测、监测机构、企业和个人选用、验收该类快检产品提供参考。方法：从纸片的污染指标、特异性指标、检出水平（LODX）、检测结果有效性和产品质量稳定性等方面进行试验研究，对纸片的性能进行综合分析和验证。结果：纸片的各项试验结果基本符合预期和产品自身的质量要求。结论：本文所探索的对湿式大肠菌群快检纸片性能进行分析验证的一般流程可有效对该类纸片产品进行较为全面的性能验证，在使用该类快检产品时可作为产品选用和验收、验证的参考。

关键词：大肠菌群;快检纸片;性能验证

大肠菌群是指一类在一定培养条件下能够发酵乳糖、产酸产气的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌[1]。湿式大肠菌群快检纸片是近年来新出现的可用于餐（饮）具或公共场所用品用具大肠菌群检测的快检产品，该类产品具有携带方便、操作简单等特点，且相较于干式快检纸片省去了使用无菌生理盐水润湿纸片的环节，从而降低了检测操作和环境污染的风险[2]。

近年来，随着各类快检产品出现的越来越多，各产品的质量也参差不齐[3-4]，产品使用单位或个人对所购买产品的性能缺乏有效了解。本文将着重探索对湿式大肠菌群快检纸片的性能进行分析、验证的一般流程，为产品使用单位或个人选用和验收、验证该类大肠菌群快检产品提供参考。

1材料和方法

1.1材料与试剂

环境样本（自然环境、居住、办公环境等）、人工污染样本。湿式大肠菌群快检纸片、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）、营养肉汤（NB）、营养琼脂（NA）、无菌接种环、无菌移液管、无菌平皿等。

标准菌株：大肠埃希氏菌（ATCC25922）、弗氏柠檬酸杆菌（ATCC43864）、产气肠杆菌（ATCC13048）、福氏志贺氏菌（CICC21534）、鼠伤寒沙门氏菌（ATCC14028）、粪肠球菌（ATCC29212）和金黄色葡萄球菌（ATCC6538）。

1.2仪器与设备

生物安全柜、冰箱（2～8℃）、培养箱（36±1）℃、涡旋振荡器、移液枪等。

1.3方法

本文将着重对纸片的污染指标、特异性指标、检出水平（LODX）、检测结果有效性和产品质量稳定性验证等方面进行试验分析。

1.3.1污染指标

选取2～4个不同批号（本次试验为4个批号：200605、200903、210505和210506）的湿式大肠菌群快检纸片产品，无菌操作，每个批号分别取5张快检纸片，装入纸片配套的无菌小袋中，置（36±1）℃培养箱中培养18h，观察结果。

1.3.2特异性指标

本文综合湿式大肠菌群快检纸片自身的产品质量要求和《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》（GB4789.28—2013）中对大肠菌群相关培养基、试剂的质量要求，确定使用大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、产气肠杆菌、福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌等7种菌对纸片进行大肠菌群的特异性验证。

验证时，用无菌接种环从上述7种菌的新鲜营养琼脂斜面上沾取一环菌，直接于纸片表面划线，然后置于（36±1）℃培养箱中培养18h，观察各菌在纸片上的特异形态。本文试验中选取了4个不同批号（同1.3.1）的纸片进行特异性验证。

1.3.3检出水平（LODX）

本文通过纸片对高、中、低3个接种水平和空白的样本匀液的测试结果来获得该纸片法的检出水平（由于测试的样品数量较少，本文中使用“估计LOD50”[5]），高、中、低3个接种水平和空白分别做2个测试，共获得8个结果。记录每个接种水平获得的阳性结果（检出）数量，使用《微生物检测方法确认与验证指南》（RB/T033—2020）附录B中的表B.1确定估计LOD50。

高水平接种量为不超过预期LOD50（预期的LOD50设定为：≤3CFU/测试单元[5]）的10倍，中水平接种量可由高水平接种物稀释2倍获得，低水平接种量可由高水平接种物稀释10倍获得。

用大肠埃希氏菌（ATCC25922）制备浓度（单位：CFU/mL）分别为高、中、低接种水平10倍的接种物匀液。测试时，无菌操作，先取适量湿式大肠菌群快检纸片置于配套的无菌袋中，然后分别吸取0.1mL（测试单元）各接种水平的接种物匀液和空白液，均匀滴加（接种）于纸片表面，每个接种水平和空白分别测试2张纸片，滴加（接种）完成后，将纸片置于（36±1）℃培养箱中培养18h，观察结果。同时，分别吸取0.1mL各水平接种物匀液和空白液加入2个无菌平皿，立即倒入15～20mL冷却至46℃的营养琼脂，摇匀，（36±1）℃培养24h，计数，对各接种水平的接种物匀液浓度和空白对照进行同步