细胞工程胚胎干细胞培养.ppt

**在正常生理条件下，成体干细胞倾向于更新并分化为所在特定组织的若干种细胞；但在特殊的外界条件诱导下，一种组织的成体干细胞能超越该特定组织，分化成其他组织功能性细胞，补充参与其他损伤组织的修复等。**ES/EG细胞的培养建系技术原则：获得全能性胚胎细胞或细胞团，并建立体外适合其增殖和抑制分化的培养系统。实际上，全能性胚胎干细胞在体外建系非常困难，目前在体外已建系的胚胎性干细胞大多数属于多能性质。**1、ES细胞可从处于胚泡时期的人晶胚中直接分离其内部细胞（ICM），经培养产生ES细胞系。?在1998年11月，威斯康星州立大学的JamesThomson从“剩余”晶胚中分离出ES细胞。2、ES细胞可从终止妊娠得到的胎儿组织中分离。从将来发育为睾丸或卵巢的胎儿区域，提取细胞。?约翰?霍普金斯大学JohnGearhart发布消息，他从流产胎儿的生殖细胞中培养出干细胞系**由于早期胚胎细胞离体后极易发生分化，首先要解决阻止其分化、确保维持其全能性或多能性这一关键问题;体外培养ES细胞可分为饲养层培养法和无饲养层培养法**原代或初期培养阶段的ES/EG细胞一般都依赖于能分泌使它们在体外存活和增殖所必需生长因子的饲养层细胞，不同类型的饲养层细胞分泌的生长因子略有不同，但都要求保持不分裂增殖而仍具代谢活性。**---往往在ES/EG原代和建系初期缺乏饲养层时，用这种条件培养液培养成功率不高，因此，正确使用饲养层细胞和条件培养液在ES细胞建系初期是成败的一个关键因素。**小鼠和包括人在内的灵长类动物全能或多能性胚胎性干细胞，具有特有的表达标志及在体内、外的分化特点。**切片可观察到瘤块除大量的干细胞巢和间质细胞外，还包括神经管、复层鳞状上皮组织（外胚层），腺管、支气管和肺泡（内胚层），软骨和肌肉（中胚层）等多种类型的分化细胞和组织。**----同一种诱导物可以诱导出不同类型细胞或变化多端的构造，不仅涉及诱导剂的浓度差别、诱导作用模式和微环境的未知因素等，而且可能与被诱导细胞本身的发育潜能和对诱导剂的反应性等差别有关。**1、哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；ES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同但在分子水平仍有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。**新近有人设想将欲接受细胞治疗者的体细胞核直接导入去核ES或EG细胞，培养专用ES细胞。尽管这类设想还没有实验室成功的报道，但是这类ES细胞技术学问题已收到人们的关注。**等涉及到正常细胞丧失或功能受损的疾病治疗上。**干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达ES的分离及培养酶消化后培养免疫方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化。**干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达ES的分离及培养酶消化后培养免疫方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化。**哈佛大学的研究者将人类神经祖细胞注射入胎儿猴看它们与猴的脑细胞如何一起生长、移动和分化。第3