全细胞催化L-叔亮氨酸的生物合成.docx

摘要：L-Tle可以作为动物饲用的添加剂以及营养的强化剂等被广泛的应用于化妆品和食品等领域。此研究借助甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶，初步研究了全细胞催化三甲基丙酮酸（TMP）来制备L-Tle生产工艺，100mM的TMP经过了24小时的转化后，L-Tle的时空产率及产率分别达到了12.48g·L-1·d和87.38%（ee99%1。总而言之，该研究初步地完成了L-Tle生物合成，为实现合成L-Tle奠定了基础。

关键词:亮氨酸脱氢酶；L-Tle；全细胞催化

0引言

很多非天然氨基酸可合成手性药物，L-Tle作为天然手性氨基酸的一种，可应用在食品和化妆品领域，也可合成生物制剂、抗病药物等。考虑到L-叔亮氨酸的价值性以及较高的需求性，在过去的时候已经开发出了很多方法，其中包括生物和化学合成法。生物法一般比化学法更加具有优势。研究运用全细胞催化法，细胞内完整多酶体系可完成酶级联反应，弥补酶催化的不足之处，增加催化效率。

对于想要通过生物催化的方法来实现大规模的工业化的生产L-叔亮氨酸而言,必须建立高效辅酶再生系统。常见辅酶再生体系可选用葡萄糖脱氢酶来催化葡萄糖、借甲酸脱氢酶催化甲酸铵[14]、借醇脱氢酶催化异丙醇，用于辅酶NADH循环再生[15]。考虑到亮氨酸脱氢酶的选择性，结合辅酶再生体系，建立一种高效催化三甲基丙酮酸转为L-

Tle途径。此研究为全细胞催化底物三甲基丙酮酸合成L-Tle。

1.材料和方法

1.1材料和试剂

1.1.1主要试剂

NAD+/NADH标准品购于索莱宝科技有限公司、IPTG购于上海生工生物工程有限公司；乙腈、色谱纯甲醇购于科密欧化学试剂有限公司；三甲基丙酮酸、DL-叔亮氨酸、GITC等试剂购于麦克林化学试剂有限公司；一站式His标记蛋白质微量纯化套装购于天恩泽基因科技有限公司，用于重组酶的快速亲和纯化。

1.2菌株、质粒及培养基

携带原核表达的质粒的E.coliBL21/pET28a的菌株由我们课题组保，主要用作于L-叔亮氨酸的生物合成反应进行阴性对照。携带有甲酸脱氢酶的E.coliBL21/pET28a-CbFDH菌株由我们课题组保藏，主要用于甲酸脱氢酶的共表达。pACYCDuet-1构建共表达载体。

LB培养基：10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠和5g/L酵母提取物，制备固体平板时加15g/L琼脂粉，常规pH值，灭菌

121℃20分钟。

1.1.3常用软件

Origin2018软件：用于数据的统计以及分析。

主要仪器和设备

UNIVERSALHood凝胶成像系统，是用于凝胶的成像；VCX130型超声破碎仪，是用于菌体的破碎：HPLC、

ThermoHypersilC18柱，用于产物定性和定量分析；蛋白电泳系统PowerPac?HC/Mini-PROTEAN?，用于产物SDS-

PAGE分析。

实验方法

重组的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-1-CbFDH-PfLeuDH：构建pET28a-CbFDH

把质粒pET28a-CbFDH作为模板扩增出含HindⅢ以及IBamHⅠ酶切位点的目的基因，把目的基因与pACYCDuet-1用限制性内切酶HindIII和BamHⅠ双酶切，被酶切后的产物经过纯化之后，用SolutionⅠ把目的基因和载体连接起来并且转入大肠杆菌BL21感受态细胞，经抗性筛选、PCR检测、双酶切及测序鉴定后获重组菌。

再以pET28a-PfLeuDH为模板扩增含XhoⅠ和NdeⅠ酶切位点目的基因，把pACYCDuet-1-CbFDH和目的基因用限制性内切酶XhoⅠ和NdeⅠ双酶切，待酶切产物经纯化后，用SolutionⅠ把目的基因和载体连接转化到感受态细胞，按照上述方法进行筛选、检测以及鉴定获得重组菌。

最后，将质粒pET28a-CbFDH及pACYCDuet-1-CbFDH-PfLeuDH转化到大肠杆菌BL21感受态细胞，经双抗性筛选，获pET28a-CbFDH的重组菌。

将上述所得重组菌连传代10次，接种继续培养，观察生长情况，借双抗筛选考察重组菌遗传的稳定性。

重组大肠杆菌全细胞转化三甲基丙酮酸合成L-亮氨酸

将重组大肠杆菌接到4mL卡拉霉素LB液体培养基，在37℃及200r/min中培养14h，接2%的量于100mLLB液体培养基，再继续培养约2.5h，加1mol/LIPTG至0.1mmol/L，在16℃及200r/min中培养约20h。将诱导后重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-FDH-PfLeuDH：pET28a-FDH，于4℃、8000r/min下离心5min，集菌体，经冷