大肠杆菌感受态细胞制备及转化.pptVIP

大肠杆菌感受态细胞

制备及转化实验目的掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法掌握转化的方法技术了解转化过程中各因素对转化率的影响感受态（Competence)：细菌处于容易吸收外源DNA的状态01转化（transformation)：异源DNA分子导入受体细胞的过程02致敏过程:用理化方法诱导细胞进入感受态的操作03定义感受态及转化实验原理01在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g.枯草杆菌）02在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g.大肠杆菌）细菌产生感受态的类型01E.ColiDH5α：无Ap抗性受体菌：02Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力选择:如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α、JM109、TG1；用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)；外源质粒受体菌与质粒的选择原生质体法01电击法02特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法03制备感受态细胞方法+1质粒DNA2420C热击3复苏4Amp+5细菌处于00C,CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面,经短时间420C热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间，使抗氨苄青霉素的表型表达后再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上，长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。6公式：转化子数/ugDNA=单菌落数质粒浓度(ng/ul)X1uL5ng/uLX10x1000转化率定义及计算细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态OD值：0.3－0.5(5X107个/ml)质粒：大小、构型器皿的洁净度试剂的质量：化合物及无机离子：Rb+、Mn+、二甲亚砜等外源DNA（质粒）与细胞的比例：污染—尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行123456影响转化效率的因素制备好的感受态细胞每100uL分装一支EP管轻轻混匀----可以用tip头轻轻搅匀.4℃保存（不加甘油），可保存一周；加30%甘油，-20℃保存，可保存一月；加30%甘油，80℃保存，可保存六月；感受态细胞的保存摇床01分光光度计02冷冻离心机03超净工作台04恒温水浴05涂布棒06恒温培养箱07实验器材LB液体培养基LB固体培养基0.1MCaCl230%甘油氨苄青霉素实验试剂01接单菌落到5mlLB液体培养基中，370C、190rpm振荡培养过夜025%（250ul)菌液接种到含5mlLB的试管中，370C振荡培养1-2小时，至OD6000.4-0.5（已完成）03将1.5mL菌液转移到离心管中04离心5000rpm，40C，5min05倒出培养液实验流程用冰预冷的1mL0.1M的CaCl2处理、悬浮细胞，.冰上20min(取1.5mL)5000rpm离心5min，倾去上清100uLCaCl2轻轻悬浮，冰浴大肠杆菌DH5α感受态的制备12-------1ml贰大肠杆菌DH5α受态的制备壹----------20min叁实验流程*