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酵母双杂交系统研究及其应用

白玉杰综述药立波审校

(第四军医大学生物化学及分子生物学教研室，西安710032)

蛋白质是生命功能的物质基础，体内包括复制、转录、分泌、信号转导、代谢等多种生命活动都依赖

于蛋白-蛋白、蛋白-核酸间的相互作用，对生命活动过程中蛋白质作用的研究有助于揭示生命过程的许多

本质问题。但由于蛋白质与其他生物大分子间作用依赖于细胞内环境，作用时间及作用力差异极大，因

而传统生化方法受到较大限制，蛋白-蛋白及蛋白-核酸间作用的研究进展缓慢。新兴起的双杂交系统应用

有效的酵母遗传学方法分析蛋白间相互作用，能快速克隆编码与某一蛋白作用的配体蛋白的基因，得到

广泛应用，在此基础上相继出现反向双杂交系统、三杂交系统等多种新技术，大大加速了此领域的研究。

一、酵母双杂交系统

(一)基本原理

酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立i。典型的真核生长转录因

子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构

域(transcription-activatingdomain)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所

调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活

作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。主要有二类载

体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。上述二类载体在构建融合

基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有

定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence)，

而GAL4-ad没有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位

的序列。目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147);LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-b

d编码序列。常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质

粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:〈1〉易于

转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性

蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结

合结构域(如GAL4-bd，LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad，VP16)。激活结构域

融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道

基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：①采用高拷贝和强

启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物

理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构

域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于

稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方

法均很敏感。

(二)酵母双杂交系统的应用

1特点与优点

酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作

用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:⑴