PCR 过程需要条件.docxVIP

PCR过程需要以下条件：

模板：含有待扩增序列的DNA、mRNA或cDNA等都可以作为PCR的模板，其数量和质量都会影响扩增效果。一般宜用纳克（ng）级的克隆DNA、微克（μg）水平的染色体DNA或102-10?拷贝待扩增的DNA片段作为起始材料，且不能有太多蛋白质和其他污染，特别是其他DNA的污染，否则会导致非特异性产物3.

引物：是与靶基因互补的短链核苷酸序列，用于引导DNA聚合酶在靶基因上进行扩增。引物的设计应遵循以下原则：长度一般为15-30bp，常用20bp左右；扩增片段长度以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段；GC含量以40%-60%为宜，ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，以防形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带2.

DNA聚合酶：是一种能够在引物的引导下，将脱氧核糖核苷酸添加到DNA链上的酶，如TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、VentDNA聚合酶、PfuDNA聚合酶和PwoDNA聚合酶等，其中TaqDNA聚合酶最为常用。TaqDNA聚合酶在90℃以上的高温下仍能保持活性，其浓度一般为1.0-2.5U/100μL反应液3.

dNTP：即四种脱氧核糖核苷酸，包括腺嘌呤脱氧核苷酸（A）、胞嘧啶脱氧核苷酸（C）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（G）和胸腺嘧啶脱氧核苷酸（T），是合成DNA的原料。dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率密切相关，其贮备液pH7.0左右，浓度一般为20mmol，-20℃保存，在反应体系中浓度为20-200μmol/L，且四种dNTP的浓度要相等，浓度过低会降低PCR产物的产量，过高则会导致特异性下降，因为dNTP能络合溶液中的Mg2?，产生错配或抑制TaqDNA聚合酶活性13.

缓冲液：提供适当的pH值和离子强度，以支持DNA聚合酶的活性和dNTP的掺入，通常采用10mmol/LTris-HCl（pH8.3-9.0，室温）缓冲液体系，其中含有可激活DNA聚合酶活性中心的二价阳离子，一般为Mg2?，以MgCl?的形式提供，Mg2?浓度高低可显著影响PCR扩增产物的特异性，此外，缓冲液中还含有50mmol/L的K?，有利于引物与模板的退火，有些缓冲液中还加入明胶或血清白蛋白及去污剂等，对TaqDNA聚合酶起稳定作用3.

镁离子：Mg2?是PCR反应中不可或缺的离子，它能与dNTP结合，对PCR扩增的特异性和产量有显著影响。一般在各种dNTP浓度为20μmol/L时，Mg2?浓度为1.5-2.0mmol/L为宜，Mg2?浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低，会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少.

温度：PCR反应需要精确控制温度，包括变性、退火和延伸三个温度阶段。双链DNA通常在90-95℃变性，使模板DNA双链解离成为单链；退火温度一般在40-60℃，使引物与模板DNA单链互补序列配对结合；延伸温度则在70-75℃，在DNA聚合酶的作用下，引物链沿模板延伸.

时间：变性时间一般2-3min，可以使模板DNA完全变性；复性时间一般为30-60s，足以使引物与模板之间完全结合；延伸反应的时间可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的.

循环次数：循环次数决定PCR扩增程度，主要取决于模板DNA的浓度，一般循环次数选在30-40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多.