谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中植物源性成分定性检测.docx

食品补充检验方法

BJS202411

谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中植物源性成分定性检测

2024-12-22发布

国家市场监督管理总局发布

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谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中植物源性成分定性检测

1范围

本方法规定了谷物碾磨粉及制品、淀粉及制品中植物源性成分的检测方法。

本方法适用谷物碾磨粉及制品(粉、粒、片及其冲调类制品)、淀粉及制品(粉丝、粉条、藕粉及其冲调类制品等)中可能含有一种植物源性成分的sanger基因测序及可能含有多种植物源性成分的高通量基因测序定性检测。可鉴别植物物种列表见附录A。

2原理

提取试样中基因组DNA,以DNA为模板,使用植物叶绿体基因(rbcL)通用引物进行PCR扩增,将扩增片段测序后与数据库比对,确定序列所属植物物种,实现样品中植物源物种成分的定性检测。

3试剂和材料

除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。试验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。

3.1植物源rbcL基因检测用引物对序列

rbcL-F:5l-AATCTTCTACTGGTACATGGAC-3l。

rbcL-R:5l-TCATCATCTTTGGTAAAATCAAG-3l。rbcL基因片段电泳长度为433bp左右。

3.2试剂

3.2.1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB,C19H42BrN)。

3.2.2氯化钠(NaCl)。

3.2.3二水乙二胺四乙酸二钠盐(Na2EDTA●2H2O,C10H14N2O8Na2●2H2O)。

3.2.4三羟甲基氨基甲烷(Tris,C4H11NO3)。

3.2.5盐酸(HCl)。

3.2.6氢氧化钠(NaOH)。

3.2.7十二烷基肌氨酸钠(C5H28NNaO3)。

3.2.8RNA酶:10mg/mL。

3.2.9蛋白酶K:20mg/mL。

3.2.10苯酚(C6H6O)。

3.2.11三氯甲烷(CHCl3)。

3.2.12125mmol/LNa2EDTA。

3.2.13乙酸钾(C2H3KO2)。

3.2.14冰乙酸(C2H4O2)。

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3.2.15异丙醇(C3H8O)。

3.2.16无水乙醇(C2H6O)。

3.2.1710×PCR缓冲液:200mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2,200mmol/LTris●HCl(PH8.8)。

3.2.18TaqDNA聚合酶:2.5U/μL。

3.2.19无菌水。

3.2.20硼酸(H3BO3)。

3.2.21琼脂糖(C24H38O19),电泳级。

3.2.22GelRed核酸染料(10000×)。

3.2.23加样缓冲液:0.25%溴酚蓝,40%(质量分数)蔗糖水溶液。

3.2.24DNA电泳分子量标准品:50bP~500bP。

3.2.25甲酰胺(CH3NO)。

3.2.26sanger基因测序试剂盒:至少包含荧光染料、测序引物、高效测序反应酶、缓冲液。

3.2.27PCR产物纯化试剂盒(磁珠法):至少包含磁珠、清洗缓冲液。

3.2.28文库构建试剂盒:至少包含连接头、标记标签、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、缓冲液。

3.2.29高通量基因测序试剂盒:至少包含测序引物、高效测序反应酶、缓冲液。

3.3试剂配制

3.3.1裂解液I:称取4.00gCTAB(3.2.1),23.4gNaCl(3.2.2),3.72gNa2EDTA●2H2O(3.2.3),4.84gTris(3.2.4),加入约160mL水溶解后,用盐酸(3.2.5)调节PH至8.0,加水定容至200mL,121℃高压灭菌20min,备用。

3.3.2裂解液Ⅱ:称取10g十二烷基肌氨酸钠(3.2.7),充分溶解后,加水定容至200mL,121℃高压灭菌20