教学课件：第十五讲蛋白质组学(二)剖析.ppt

蛋白质芯片检测示意图基本原理将各种蛋白质（探针）有序地固定于载体上，制备蛋白芯片。常用载体：滴定板、滤膜或载玻片。利用蛋白与分子之间相互作用的原理，用标记了特定荧光抗体的蛋白质或其他成分（报告分子）与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去。利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度。通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质相互作用的关系，测定各种蛋白质功能。分类：根据用途的不同，可分为4、分类：根据用途的不同，可分为蛋白功能芯片：（用于研究）将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上制成芯片用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量分析可用来进行蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白-DNA-RNA结合以及蛋白-酶反应等研究。蛋白检测芯片：（用于检验）将具有高度亲和性的蛋白质或多肽（如单抗，小片段抗体，受体等）固定在载体上，制备检测芯片。用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白等。蛋白质芯片的制备信号的检测及数据处理——仪器和软件报告分子（探针）的标记010203操作关键环节蛋白质芯片的制备固相载体的选择和处理（膜载体和玻璃载体）；蛋白质靶标的处理；将蛋白质靶标点在固相载体上，并将其固定；蛋白质芯片的封闭。报告分子（探针）的标记荧光染料酶融合表达红色荧光蛋白（RFP）和绿色荧光蛋白（GFP）与检测蛋白形成融合蛋白共表达信号的检测及数据处理荧光标记的芯片：激光共聚焦或电荷耦合器件（CCD）检测酶标芯片：显色后用高精度的CCD检测应用计算机软件对检测结果进行数据分析，得出结论。高通量、高灵敏度、操作自动化、重复性好大量蛋白质的快速、定性、定量（？）分析使用简单，结果正确率较高只需少量标本采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强其不足在于：稳定性，操作复杂蛋白质芯片的特点7、蛋白质芯片的应用基础研究蛋白质－DNA相互作用研究蛋白质－mRNA相互作用研究临床：疾病诊断与疗效判定 需要的时间短、样品量少， 给出大量的诊断和预后信息。新药筛选与研制 寻找药物的靶标，检查药物的毒副作用， 高通量筛选，缩短药物筛选时间环境监测及食品检测诊断举例：国内临床上应用较多的蛋白质芯片（C-12）多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统主要是检测患者血清中的肿瘤标志物含量及变化情况，作为判断常见肿瘤的发生、发展、治疗效果及其预后的监测指标。C-12多种肿瘤标志物蛋白质芯片检测系统原理及操作步骤原理操作分析靶分子识别分子报告分子第十五讲蛋白质组学（二）第一节概述第二节蛋白质组学研究技术一、二维凝胶电泳技术二、质谱技术三、酵母双杂交体系四、蛋白质芯片技术第三节蛋白质组学的应用和发展趋势第二节蛋白质组学研究技术二、质谱技术1、概述：质谱技术按照离子的核质比（m/z）对离子进行分离并鉴定的方法。质谱技术诞生于20世纪初，一直应用于有机小分子领域．直到20世纪80年代才渐渐进入到生物大分子领域。质谱技术在蛋白质组研究中的作用在蛋白质组学研究中，蛋白质鉴定是最关键的一环。质谱技术是蛋白质鉴定的主流技术，蛋白质组研究的主要支撑技术。对蛋白质和多肽而言，质谱技术用于确定蛋白质或多肽的分子质量。通过分子量对蛋白质进行鉴定或性质研究。2、质谱仪的工作原理基本原理分子被离子化，离子化的分子，经过磁场或电场彼此分离，根据不同离子质荷比(m/z)的差异，对离子进行分离并确定分子质量。质谱仪组成：进样装置、离子化源、质量分析器、 离子检测器和数据分析等离子化源和质量分析器是两个核心部件质谱仪分类：根据两个中心部件可以分为电啧雾(ESI)快原子轰击质谱(FAB)飞机时间质谱四极杆质谱工作原理不同离子源和质量分析器相匹配——基本确定了质谱仪的工作原理和方式。如：ESI离子源与四极杆、离子阱质量分析器相匹配如：基质辅助的激光解析离子化源与飞行时间分析器相结合，（MALDI-TOF-MS）。质量分析器离子化源ESI离子化过程2、常用生物质谱的类型和特点ESI过程图解（引自理查德J.辛普森.蛋白质与蛋白质组学实验指南,2006）电喷雾质谱仪（ESI-MS）电喷雾离子化(elcctrosprayionizationESI)：一种“软电离”方式将样品溶解，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，微滴溶剂蒸发，微滴表面的电荷密度随半径减小而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，实现样品的离子化。特点：ESI-MS