真菌显微镜标本制.ppt

酵母菌的血球计数技术真菌显微镜标本制备与形态观察技术

实验原理酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水—碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。

STEP5STEP4STEP3STEP2STEP1美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。

1、菌种活化将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，25~28℃培养48h左右备用。2、美蓝镜片的观察1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，2)然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。3）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。再将多余的染液用滤纸吸干。4）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

5）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。6）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。3、水一碘液镜片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。

蜉蝣体表面的酵母菌

实验原理霉菌为真核微生物，菌丝较粗大，有分枝或不分枝的。菌丝体为五色透明或暗褐色至黑色，或呈现鲜艳的颜色。在显微镜下观察时，菌丝皆呈管状。在固体培养基上生长，为绒毛状或棉絮状。一些较高等的霉菌丝状管道中皆有横隔，由横格状菌丝隔成许多细胞。细胞易收缩变形，而且孢子很容易分散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。该染色液使细胞不变形，具有防腐杀菌作用，且不易干燥．，能保持较长时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。

水浸片法观察取一块洁净的载玻片，于载玻片的中央加一滴美蓝染色液，按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。用洁净的加盖玻片轻轻盖上，注意不要产生气泡，置于显微镜下观察，菌丝呈兰色，颜色的深度随菌龄的增加而减弱各种霉菌的形态结构观察毛霉时，注意观察其菌丝无横隔、孢子囊柄、囊轴、孢子囊孢子及后垣孢子。观察根霉时，注意观察其菌丝有无横隔、假根、孢子囊柄、孢子囊、囊轴、囊托、孢子囊孢子及厚垣孢子。观察曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、足细胞、分生孢子梗、顶囊、小梗（形状、层数及着生情况）、分生孢子。观察青霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子梗、帚状枝（小梗的轮数及对称性）、分生孢子。观察红曲霉时，注意观察其菌丝有横隔、分生孢子着生情况、闭囊壳、子囊孢子。

酵母菌的血球计数技术

酵母菌的血球计数将稀释后的酵母菌悬液,用吸管吸取一滴置于盖玻片的边缘,使菌液缓缓渗入,多余的菌液用吸水纸吸取,捎待片刻,使酵母菌全部沉降到血球计数室内.02将血球计数板用擦镜纸擦净,在中央的计数室上加盖盖玻片.01

计数原则01计数时,02如果使用16格×25格规格的计数室,要按对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个小格)的酵母菌数.03如果规格为25格×16格的计数板,除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格(即80个小方格)的酵母菌数.

当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左方线上的酵母细胞).对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.

3.计算公式

酵母细胞数/ml=100小格内酵母细胞个数/100×400×10000×稀释倍数(1)16格×25格的血球计数板计算公式:01酵母细胞数/ml=80小格内酵母细胞个数/80×400×10000×稀释倍数

(2)25格x16格的血球计数板计算公式:02

单位转换011mm3→1mL3021mm3×10000＝1mL3

血球汁数板使用后,用自来水冲洗,切勿用硬物洗刷,洗后自行晾干或用吹风机吹干,或用95%的乙醇,无水乙醇,丙酮等有机溶剂脱水使其干燥.通过镜检观察每小格内是否残留菌体或其他沉淀物.若不干净,则必须重复清洗直到干净为止.

希望各位多多指教！演示结束！