第二章 基因工程制药part2课件.ppt

第二章基因工程制药part2基因工程菌培养设备发酵罐的结构材料的稳定性要好，一般要应用不锈钢制成罐体表面光滑易清洗，灭菌时没有死角与发酵罐连接的阀门要用膜式阀，不用球形阀所有的连接接口均要用密封圈密封，不留“死腔”，不得有泄露搅拌器转速和通气应适当第二章基因工程制药part2基因工程菌培养设备空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料培养液要经化学处理或热处理后才可排放发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才能将废气放出。轴封可采用磁力搅拌或双端面密封第二章基因工程制药part2受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序四、基因工程菌的稳定性重组工程菌的遗传不稳定性的产生机制第二章基因工程制药part2重组工程菌的遗传不稳定性的产生机制重组质粒在受体细胞质粒分裂时的不均匀分配这是重组质粒逃逸的基本原因受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2重组质粒的逃逸率当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为重组质粒的宏观逃逸率。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2重组质粒的逃逸率重组质粒逃逸的原因有：高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料促进重组质粒渗透受体细胞中的核酸酶降解重组质粒重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒拷贝数的差异随着细胞分裂次数增多而加剧四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2质粒稳定性分析方法：将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂布于不含抗性标记抗生素的平板培养基，培养10~12h，然后随机挑选100个菌落接种到含抗性标记抗生素的平板培养基上，统计长出的菌落数。每一个样品应取3次重复的结果，计算出比值，该比值反映了质粒的稳定性。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2影响基因工程稳定性的因素遗传特性载体的性质宿主的选择外源基因整合到宿主染色体发酵工艺培养基生长速率限制性基质温度pH和溶氧外源基因表达四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2培养基一些基因重组菌在复合培养基中显示较高的质粒稳定性微生物在含有有机氮源如酵母抽提物、蛋白胨等营养丰富的复合培养基中培养时，由于培养基提供了生长必须的氨基酸和其他物质，微生物的生长较在基本培养基中快。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2比生长速率基因重组细菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的影响。提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。基因重组细菌的比生长速率与培养环境有关，如温度、pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。在一定的温度和pH下，限制性基质浓度往往是决定比生长速率的主要因素。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2限制性基质一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养，微生物的生长通常会受到一种或是几种物质的限制。限制性基质的种类对重组菌有不同的影响。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2pH和溶解氧pH和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重组菌时，通常都需要维持一定的pH和溶氧水平。在基因重组菌的高密度培养时，为了维持所需的溶氧水平，除了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以提高发酵罐的供氧能力。pH和溶氧影响重组酵母菌的稳定性。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2外源基因的表达外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定性外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。四、基因工程菌的稳定性第二章基因工程制药part2施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素