蛋白质的研究方法.ppt

印跡技術(blotting)是指將存在於凝膠中的生物大分子轉移（印跡）於或直接放在固定化介質上並加以檢測分析的技術1975年，EdwenSouthern提出了分子印跡(漬)的概念目前這種技術已被廣泛用於DNA、RNA和蛋白質的檢測印跡技術的類別及應用DNA印跡技術(Southernblotting)用於基因組DNA、重組質粒和噬菌體的分析RNA印跡技術(Northernblotting)用於RNA的定性定量分析蛋白質的印跡分析(Westernblotting)用於蛋白質定性定量及相互作用研究由於蛋白質常用抗體來檢測，因此也被稱為免疫印跡技術(immunoblotting)一、免疫印跡分析的應用對蛋白質進行定性分析對蛋白質進行半定量分析信號轉導分析生物大分子相互作用分析二、免疫印跡分析的基本流程電泳分離蛋白轉移至固相膜封閉非特異結合位點與第一抗體溫育反應與第二抗體交聯物溫育反應顯色製備蛋白樣品蛋白質轉移抗體檢測1.紫外光譜(A280)吸收法這一方法可用來快速檢測溶液中是否含有蛋白質成分。通常用於柱層析過程中檢測蛋白質的洗脫峰原理色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近大多數蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收優點快速缺點核酸可引起強干擾作用芳香族氨基酸含量差異可以起誤差對蛋白質無破壞性不是嚴格的定量，適用於測定蛋白質粗提液計算方法標準曲線法蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事項石英比色杯調零所用溶液配製標準蛋白所用溶液光密度範圍2.考馬斯亮藍G-250檢測法這是一種迅速、可靠的通過染色法測定溶液中蛋白質含量的方法原理該法是基於考馬斯亮藍G-250有紅、藍兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下，可配成淡紅色溶液，當與蛋白質結合後，產生藍色化合物，反應迅速而穩。藍色複合物在595mn波長處具有最大光吸收值，並與溶液中蛋白質濃度成正比，因此可檢測595mn的光吸收值大小計算蛋白的含量所需時間10min優點快速（反應時間僅需2min）敏感，幾乎沒有蛋白質損失缺點用這種測定方法對蛋白質引起不可逆的變性對各種純化蛋白質反應不同計算方法標準曲線法注意事項反應10～15min後開始出現沉澱，尤其是高濃度蛋白質溶液在酸性條件下易發生沉澱若選用目的蛋白來做標準曲線或用另一種方法來校正，所測蛋白濃度較準確3.Lowry檢測法這一標準、快速的蛋白質定量檢測方法已得到廣泛應用.原理首先在鹼性溶液中形成銅-蛋白複合物，然後這一複合物還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)，產生鉬藍和鎢藍複合物的深藍色，這種深藍色的複合物在745～750nm處有最大的吸收峰，顏色的深淺(吸收值)與蛋白質濃度成正比，可根據750nm的光吸收值大小計算蛋白質的含量優點一種可靠的蛋白質定量方法不同蛋白質之間差別很小缺點某些試劑不穩定干擾物質多使蛋白質發生不可逆變性計算方法標準曲線法注意事項在加入試劑30min後呈色達到飽和，時間延長顏色信號減弱許多干擾物質降低顏色反應高鹽濃度可引起沉澱4.BCA(二喹啉甲酸)檢測法這是近年來新研製的一種改進的Lowry測定法原理在鹼性環境下蛋白質分子中的肽鍵能與Cu2＋生成絡合物，同時將Cu2＋還原成Cu＋。而BCA試劑可敏感特異地與Cu＋結合，形成穩定的有顏色的複合物，在562nm處有高的光吸收值。顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，可根據吸收值的大小來計算蛋白質的含量優點檢測敏感性高缺點蛋白質發生不可逆的變性終產物穩定巰基試劑和去垢劑干擾第三節蛋白質相對分子量測定分子量測定(molecularweight,MW)凝膠層析沉降平衡超速離心動態彈性光散射孔徑梯度電泳（SDS）質譜(ESI-MS)一、SDS測定蛋白質的相對分子量1.不連續系統原理2.SDS凝膠的製備製備分離膠製備濃縮膠加樣裝板電泳卸板並進行凝膠