体外哺乳类细胞TK基因突变试验.docx

中华人民共和国国家标准

犌B15193．20—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞T犓基因突变试验

2014-12-24发布

2015-05-01实施

中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会

发布

Ⅰ

犌B15193．20—2014

前言

本标准代替GB15193．20—2003《TK基因突变试验》。

本标准与GB15193．20—2003相比，主要变化如下：

—标准名称修改为“食品安全国家标准体外哺乳类细胞TK基因突变试验”；—修改了范围；

—增加了术语和定义；

—修改了试验目的和原理；

—增加了代谢活化系统；

—增加了THMG和THG选择培养基的配制方法；

—增加了CHAT和CHT选择培养基的配制方法；

—增加了三氮胸昔的配制方法；

—增加了磷酸盐缓冲液的配制方法；

—修改了受试物剂量设定的要求；

—修改了对照的设定；

—增加了备选细胞系及相应的试验方法及数据处理；

—增加了试验报告的要求；

—增加了试验的解释的要求。

1

犌B15193．20—2014

食品安全国家标准

体外哺乳类细胞T犓基因突变试验

1范围

本标准规定了体外哺乳类胸昔激购(thymidinekinase，TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。

本标准适用于评价受试物的致突变作用。

2术语和定义

2．1T犓基因

哺乳类动物的胸昔激购基因。人类的TK基因定位于17号染色体长臂远端；小鼠的则定位于11号染色体。

2．2突变频率

在某种细胞系中，某一特定基因突变型的细胞(集落)占细胞(集落)总数的比例(单位通常为10－6)。

3试验目的和原理

TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。TK基因突变属于常染色体基因突变。

TK基因的产物胸昔激购在体内催化从脱氧胸昔(TdR)生成胸昔酸(TMP)的反应。在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘹陡核昔酸(dUMP)，即由胸昔酸合成购催化的dUMP甲基化反应生成TMP。但如在细胞培养物中加入胸昔类似物(如三氮胸昔，即trifluorothymidine，TFT)，则TFT在胸昔激购的催化下可生成三氮胸昔酸，进而掺入DNA，造成致死性突变，故细胞不能存活。若TK基因发生突变，导致胸昔激购缺陷，则TFT不能磷酸化，亦不能掺入DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。根据突变集落形成数，可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同的集落，即大／小集落(L5178Y细胞)或正常生长／缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落／正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落／缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。

4仪器和试剂

4．1仪器

实验室常用设备、低温冰箱(－80℃)或液氮罐、生物安全柜、细胞培养箱、倒置显微镜、离心机。

2

犌B15193．20—2014

4．2培养基

4．2．1完全培养基

RPMI1640培养液，加入10％马血清(培养瓶培养)或20％马血清(96孔板培养)及适量抗菌素(青霉素、链霉素的最终浓度分别为100IU／mL及100μg／mL)。

4．2．2THM犌和TH犌选择培养基

THMG培养基：3μg／mL胸腺嘹陡核昔(thymidine，T)＋5μg／mL次黄嘿岭(hypoxanthine，H)＋0．1μg／mL氨甲哄岭(methotrexate，M)＋7．5μg／mL甘氨酸(glycine，G)。

THG培养基：3μg／mL胸腺嘹陡核昔(T)＋5μg／mL次黄嘿岭(H)＋7．5μg／mL甘氨酸(G)。

以上浓度为各试剂在培养基中的终浓度。实际试验中，常按照表1的方法把THMG和THG配成100倍浓度：

表1T、H、M、犌试剂的配置

试剂

相对分子质量

质量／mg

溶剂及其体积

浓度／(mg／mL)

T

242．2

30

10mLHO

3

H

136．1

5

1mL1mol／LHCl

5

M

454．5

5

50mLHO

0．1

G

75．07

75

10mLHO

7．5

将4种试剂配制成上述1