芍药甘草汤对脑缺血再灌注损伤后小胶质细胞稳态和血脑屏障完整性的影响.pdfVIP

中文摘要

研究目的

芍药甘草汤（SGD）已被证明能够有效改善脑卒中神经功能结局。

目前，SGD干预是否引起小胶质细胞异质性和稳态基因表达的变化未见报道。

本研究通过单细胞转录组测序技术和动物实验，应用脑缺血再灌注大鼠模型，

聚焦于小胶质细胞稳态标记基因P2ry12及其介导维持血脑屏障（BBB）完整性，

探讨SGD如何影响脑缺血再灌注（CI/RP）损伤后小胶质细胞异质性，以及

SGD是否可以通过调节小胶质细胞稳态基因来维持稳态和小胶质细胞功能，进

而减轻CI/RP损伤，旨在为SGD应用于临床治疗脑卒中提供实验室依据。

研究方法

本研究采用雄性SD大鼠，随机分为Sham组、MCAO24h组、MCAO7d组

和SGD7d组。MCAO组和SGD组大鼠均接受大脑中动脉栓塞（MCAO）手术，

并在术后24h进行Zea-longa评分，将得分1~3分的大鼠纳入后续研究；Sham组

接受假手术处理。对所有大鼠在MCAO术后24h应用改良神经功能缺损评分法

（mNSS）进行神经功能缺损症状的评估。SGD组在MCAO术后24h后开始接

受浓度为1.05g/mL的SGD灌胃，给药剂量为16.8g/kg，每天一次，连续6天；

MCAO7d组大鼠灌服等量生理盐水，每天一次，连续6天。干预后再次进行

mNSS评分。通过单细胞转录组测序和批量转录组测序技术，对Sham组、

MCAO24h、MCAO7d和SGD7d组去除梗死核心后的皮层脑组织进行测序，并

进行降维聚类、差异基因富集、功能富集和拟时序等下游分析，寻找可能的

SGD治疗靶点。采用Westernblotting检测缺血皮层半暗带P2ry12的蛋白表达水

平；采用伊文思蓝染色法检测BBB的完整性；采用双重免疫荧光检测P2ry12阳

性小胶质细胞的数量以及P2ry12在小胶质细胞上的表达情况，并观察小胶质细

胞的形态变化。

研究结果

1.SGD减轻MCAO模型大鼠CI/RP后神经功能缺损症状

造模后MCAO组大鼠的评分显著高于Sham组（***P＜0.001），SGD组干

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预后第7天mNSS评分明显低于MCAO7d组（P＜0.001）。

2.CI/RP后皮层脑组织中细胞群的鉴定

单细胞转录组测序一共保留50031个细胞用于进一步分析，第一轮降维聚类

后鉴别出40个细胞群，主要的细胞类型包括小胶质细胞、少突胶质细胞、内皮

细胞、星形胶质细胞、单核细胞源性巨噬细胞、边界巨噬细胞、神经元、壁细

胞、B细胞、T细胞、NK细胞和室管膜细胞。P2ry12、Tmem119、Gpr34、Sall1、

Slc2a5、P2ry13等已知的小胶质细胞特异性标记基因在区分小胶质细胞和其他

细胞类型时表现出良好的可靠性。细胞群1、2、3、4、6、7、8、9、11、18和

37被认为是小胶质细胞。

3.SGD减轻了CI/RP后小胶质细胞的细胞异质性

将25859个小胶质细胞进行第二轮降维聚类，鉴别出了15个小胶质细胞亚

群。小胶质细胞亚群大小占所有小胶质细胞总量的0.07%到18.01%不等。Sham

组主要由亚群4、6和8组成；MCAO24h组主要由亚群1和5组成；MCAO7d

组主要由亚群3、9、10和12组成；SGD7d组主要包括亚群0、2和7。

四组样本中的小胶质细胞转录谱发生了明显的变化，在拟时序轨迹图中也

发现了同样的趋势：Sham组的小胶质细胞从起始侧占据了三个独立的轨迹分支，

MCAO24h组的小胶质细胞表现出与Sham组较为相似的功能变化，MCAO7d组

的亚群主要占据分支点2的所有分支，位于细胞分化的末端，而SGD7d组的亚

群在全部5个轨迹分支几乎都有分布。

4.小胶质细胞的功能分析

亚群1、5和13与免疫反应和细胞分化相关，富集了细胞对脂多糖的反应、

白细胞增殖、细胞对外界刺激的反应、分化、淋巴细胞增殖的调节和单核细胞

增殖的调节等细胞功能。亚群3、9、10和11高度富集于与白细胞和淋巴细胞相

+

关的功能，如CD4αβT细胞活化的正向调节、T细胞分化的正向调