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酶的分離純化

3.1酶的提取、分離純化技術路線細胞破碎酶提取酶分離純化酶濃縮酶貯存動物、植物或微生物細胞發酵液離心分離，過濾分離，沉澱分離，層析分離，電泳分離，萃取分離，結晶分離等。

酶的純化過程，約可分為三個階段：(1)粗蛋白質(crudeprotein):採樣→均質打破細胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉澱法；可以粗略去除蛋白質以外的物質。(2)部分純化(partiallypurified):初步的純化，使用各鐘柱層析法。(3)均質酶(homogeneous):目標酶的進一步精製純化，可用製備式電泳或HPLC。酶分離純化不同階段本章目錄

3.2細胞破碎許多酶存在於細胞內。為了提取這些胞內酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機

機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶製劑法通過機械運動產生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結構破壞，而使細胞破碎。通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶製劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理本章目錄

酶的提取是指在一定的條件下，用適當的溶劑或溶液處理含酶原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時首先應根據酶的結構和溶解性質，選擇適當的溶劑。一般說來，極性物質易溶於極性溶劑中，非極性物質易溶於非極性的有機溶劑中，酸性物質易溶於鹼性溶劑中，鹼性物質易溶於酸性溶劑中。酶都能溶解於水，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等進行提取，有些酶與脂質結合或含有較多的非極性基團，則可用有機溶劑提取。3.3酶的提取提高溫度，降低溶液粘度、增加擴散面積、縮短擴散距離，增大濃度差等都有利於提高酶分子的擴散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率並防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。

酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用於提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用於提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩定性較好的酶堿溶液提取PH8～12的水溶液用於提取在稀堿溶液中溶解度大且穩定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用於提取那些與脂質結合牢固或含有較多非極性基團的酶大多數蛋白類酶都溶於水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現象。本章目錄

3.4酶的分離方法1、沉澱分離2、離心分離3、過濾與膜分離4、層析分離GoGoGoGo5、電泳分離Go6、萃取分離Go本章目錄

1、沉澱分離沉澱分離是通過改變某些條件或添加某種物質，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉澱析出，與其它溶質分離的技術過程。沉澱分離方法分離原理鹽析沉澱法利用不同蛋白質在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質從溶液中析出沉澱，從而使酶與雜質分離等電點沉澱法利用兩性電解質在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質有不同的等電點這一特性，通過調節溶液的pH值，使酶或雜質沉澱析出，從而使酶與雜質分離有機溶劑沉澱法利用酶與其它雜質在有機溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機溶劑，使酶或雜質沉澱析出，從而使酶與雜質分離複合沉澱法在酶液中加入某些物質，使它與酶形成複合物而沉澱下來，從而使酶與雜質分離選擇性變性沉澱法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質變性沉澱，而不影響所需的酶，從而使酶與雜質分離

在鹽濃度達到某一界限後，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現象。在一定的溫度和pH值條件下（β為常數），通過改變離子強度使不同的酶或蛋白質分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強度的條件下（KsI為常數），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質分離的方法，稱為β分段鹽析。在蛋白質的鹽析中，通常採用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由於硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度係數小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價廉易得。然而用硫酸銨進行鹽析時，緩衝能力較差，而且銨離子的存在會干擾蛋白質的測定，所以有時也用其他中性鹽進行鹽析。在鹽析時，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度表示。

有機溶劑之所以能使酶沉澱析出。主要是由於有機溶劑的存在會使溶液的介電常數降低。例如，20℃時水的介電常數為80，而