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中国药品检验标准操作规范2025年版95抗生素微生物检定法

95抗生素微生物检定法

一、概述

抗生素微生物检定法是利用抗生素对特定微生物具有抑制生长或杀灭作用的原理测定抗生素效价的方法。本法系在适宜条件下，根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制程度，以对比法测定供试品效价的一种方法。该方法具有灵敏度高、需用量少、测定结果较符合临床实际等优点，广泛应用于抗生素的质量控制和研究中。

二、适用范围

本法适用于各种抗生素原料药、制剂及生物制品中抗生素效价的测定。对于一些化学结构明确、可采用理化方法测定含量的抗生素，微生物检定法也可作为一种补充方法，以验证其生物活性。

三、原理

抗生素微生物检定法的基本原理是量反应平行线原理。在一定条件下，抗生素的剂量与抑菌圈直径或对数剂量与抑菌圈直径的平方呈直线关系。通过比较标准品与供试品对同一试验菌的抑菌作用，根据平行线原理计算供试品的效价。

四、试验菌

试验菌的选择应根据抗生素的抗菌谱和作用机制来确定。常用的试验菌有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌等。试验菌应采用国家药品检定机构分发或认可的标准菌株，并按规定的条件进行保存和传代。

试验菌的制备方法如下：

1.菌种的复苏：将冻干菌种接种于适宜的培养基中，在规定的温度下培养一定时间，使菌种复苏。

2.菌液的制备：取复苏后的菌种，接种于适宜的培养基中，培养至对数生长期，用无菌生理盐水或其他适宜的稀释剂稀释成一定浓度的菌液。菌液的浓度应根据试验要求进行调整，一般以每毫升含菌数为10?-10?个为宜。

五、培养基

培养基的选择应根据试验菌的生长特性和抗生素的性质来确定。常用的培养基有营养琼脂培养基、葡萄糖蛋白胨琼脂培养基、酵母浸出粉胨琼脂培养基等。培养基的制备应严格按照规定的配方和方法进行，确保其质量稳定。

培养基的质量控制包括以下几个方面：

1.外观检查：培养基应均匀、透明，无沉淀、无浑浊、无异味。

2.pH值检查：培养基的pH值应符合规定的范围，一般为6.5-7.5。

3.无菌检查：培养基应进行无菌检查，确保无杂菌生长。

4.灵敏度检查：培养基应进行灵敏度检查，用已知效价的标准品进行试验，其抑菌圈直径应符合规定的范围。

六、缓冲液

缓冲液的作用是维持试验环境的pH值稳定，保证抗生素的活性和试验结果的准确性。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液等。缓冲液的制备应严格按照规定的配方和方法进行，确保其pH值和离子强度符合要求。

缓冲液的质量控制包括以下几个方面：

1.pH值检查：缓冲液的pH值应符合规定的范围，一般误差不超过±0.05。

2.无菌检查：缓冲液应进行无菌检查，确保无杂菌生长。

七、标准品与供试品

1.标准品：标准品是指由国家药品检定机构分发或认可的具有准确效价的抗生素对照品。标准品应按照规定的条件进行保存和使用，避免其效价发生变化。

2.供试品：供试品是指待测定效价的抗生素原料药、制剂或生物制品。供试品的制备应根据其性质和试验要求进行处理，如溶解、稀释、过滤等。供试品的溶液应在规定的时间内使用，避免其效价发生变化。

八、检定方法

抗生素微生物检定法分为管碟法和浊度法。管碟法是利用抗生素在琼脂培养基中扩散，形成抑菌圈，通过测量抑菌圈的直径来测定抗生素效价的方法；浊度法是利用抗生素对试验菌生长的抑制作用，通过测量培养液的浊度变化来测定抗生素效价的方法。

（一）管碟法

1.双剂量法

-操作步骤

-制备菌层平板：将融化并冷却至48-50℃的培养基与菌液按一定比例混合均匀，迅速倒入无菌平皿中，制成菌层平板。

-放置牛津杯：待菌层平板凝固后，在平板上放置牛津杯，每个平板放置4个牛津杯，呈等距离排列。

-加样：分别向4个牛津杯中加入高浓度标准品溶液（S?）、低浓度标准品溶液（S?）、高浓度供试品溶液（T?）和低浓度供试品溶液（T?）。高、低浓度的剂距一般为2:1或4:1。

-培养：将加样后的平板置于适宜的温度下培养一定时间，使抗生素在培养基中扩散并抑制试验菌的生长。

-测量抑菌圈直径：用游标卡尺或抑菌圈测量仪测量每个抑菌圈的直径，精确至0.1mm。

-效价计算

设高浓度标准品溶液的抑菌圈直径为M?，低浓度标准品溶液的抑菌圈直径为M?，高浓度供试品溶液的抑菌圈直径为N?，低浓度供试品溶液的抑菌圈直径为N?。

效价比值（P）的计算公式为：

\(P=\frac{I}{M?-M?+N?-N?}\times(N?+N?-M?-M?)\