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中南民族大学药学院

化学生物学教研室

尼龙固定化木瓜蛋白酶

化学生物学实验

1.实验目的

化学生物学实验

6学时

1

2

学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。

掌握共价结合法固定化酶的原理和方法。

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2.实验原理

化学生物学实验

6学时

1

2

3

4

酶不与产品混合，制品易于纯化。

在大多数情况下，可提高酶的稳定性。

提高酶的使用效率，降低生产成本。

利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产

定义：通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载

体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内

进行催化反应的酶称为固定化酶。

固定化酶的优越性主要表现在：

2.实验原理

化学生物学实验

6学时

包埋法

共价键

结合法

交联法

酶的固定化方法有：

吸附法

(物理吸附、离子吸附)

1

2

3

4

2.实验原理

化学生物学实验

6学时

本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键

经HCl水解后，产生游离的-NH2基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛

中的一个-CHO基缩合，戊二醛中的另一个-CHO基则与酶中的游离氨

基缩合，形成尼龙(载体)-戊二醛(交联剂)-酶，即尼龙固定化酶。

—[NH(CH2)6NHCO(CH2)4CO]n—

HCl

~R-CH2-NH2

OHC-CH2-CH2-CH2-CHO

~R-CH2-N=CH-CH2-CH2-CH2-CHO

目标产物

4.实验步骤

1、固定化酶的制备

(1)每组取5块尼龙布洗净、晾干，浸入10mL混合液（取1.86mL

18.6%CaCl2溶液加入8.14mL甲醇溶液中，注意要现配现用）

中10s左右，取出后用水冲洗、干净，用吸水纸吸干。

(2)尼龙布用3.65mol/LHCl溶液在室温下水解45min，用蒸馏水

冲洗三次至pH中性。

(3)将尼龙布用5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联20min。

(4)取出尼龙布，用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)反复洗涤，

洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液(0.5～1mg/mL)在

4℃下固定3.5h(酶液用量每块尼龙布不宜超过0.8mL)。

(5)从酶液中取出尼龙布(保留残余酶液作测定用)，用

0.5mol/LNaCl溶液(用0.1mol/L，pH值7.2的磷酸缓冲液配制)洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。

化学生物学实验

6学时

4.实验步骤

化学生物学实验

6学时

2、酶活力测定

(1)溶液酶活力测定：取0.2mL酶液，加入2.3mL激活剂，于

37℃下预热10min，加入37℃预热的1%酪蛋白溶液mL，

准确反应10min，然后加入10%三氯乙酸溶液1.5mL终止

酶反应。对照管先加入10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶

液，其他与测定管相同，以8000r/min的转速离心10min或

过滤，取其上清液于波长280nm处测定吸光度。在上述条

件下，每10min增加0.001个吸光度为1个酶单位(U)。

(2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。

(3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入2.5mL激

活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。

4.实验步骤

化学生物学实验

6学时

表1酶活力测定

试剂

溶液酶

固定化酶

残留酶

CK

1

2

CK

1

2

CK

1

2

激活剂（mL）

1.8

1.8

1.8

2.0

2.0

2.0

1.8

1.8

1.8

酶液/固定化酶（mL或块）

0.2

0.2

0.2

1块

1块

1块

0.2

0.2

0.2

37℃保温5min

37℃1%酪蛋白（mL）

－

1

1

－

1

1

－

1

1

37℃反应10min

20%TCA(ml)摇匀

2

2

2

2

2

2

2

2

2

1%酪蛋白（mL）

1

－

－

1

－

－

1

－

－

过滤

5.实验数据处理及计算

化学生物学实验

6学时

活力回收=

固定化酶总活力数

溶液酶总活力数

×

100%

相对活力=

固定化酶总活力数

(溶液酶总活力数-残留酶活力数)

×

100%

6.注意事项

尼龙布的处理是本实验成败的关键，既要让其充分地活化，又不能使其破碎。

固定化酶溶液浓度最好为0.5～1mg/mL，对每块尼龙布用量不宜超过0.8mL。

酶活性测定的反应时间一定要准确。

过滤操作要规范。

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