医学生物化学与分子生物学实验指南.docxVIP

医学生物化学与分子生物学实验指南

医学生物化学与分子生物学实验是连接基础理论与临床应用的重要桥梁，其核心在于通过规范操作与严谨设计，揭示生物大分子的结构、功能及相互作用规律。实验过程需兼顾科学性与可重复性，以下从实验前准备、基本操作技术、常见实验项目及数据处理等方面展开详细说明。

一、实验前准备

实验前的充分准备是确保结果可靠的关键，需从理论认知、试剂器材及环境控制三方面入手。

首先，明确实验目的与原理是基础。例如进行DNA提取实验前，需理解不同生物样本（如动物组织、血液、细菌）的裂解机制——动物细胞主要通过表面活性剂（如SDS）破坏细胞膜，释放核内DNA；细菌则需溶菌酶破坏细胞壁后联合蛋白酶K消化蛋白质。同时，需掌握关键试剂的作用：酚氯仿混合液利用蛋白质变性特性实现核酸与蛋白分离，无水乙醇通过降低溶液介电常数促使DNA沉淀。理论不足时，应查阅经典教材（如《分子克隆实验指南》）或权威文献，避免因原理模糊导致操作偏差。

其次，试剂配制与器材检查需严格规范。试剂配制需使用去离子水（电阻率≥18.2MΩ·cm），称量时优先选择万分之一天平，固体试剂需完全溶解（必要时加热助溶）。例如配制1×TAE电泳缓冲液（50×母液稀释），需确认EDTA完全溶解（pH调至8.0），避免因缓冲能力不足导致电泳条带弥散。器材方面，移液器需定期校准（每3-6个月），校准方法为称量不同量程下纯水重量（20℃时1μL水≈1mg），误差超过±1%需返厂维修。离心机需检查转子是否清洁、离心管是否对称放置（重量差≤0.1g），超速离心机需提前预冷至4℃，避免因温度波动影响大分子构象。

环境控制方面，分子生物学实验需分区操作：试剂准备区、样本处理区、扩增区及产物分析区需物理隔离，避免交叉污染。PCR实验尤其需注意：引物、dNTP等试剂应分装保存（-20℃），避免反复冻融；样本处理需在生物安全柜中进行（BSL-2级实验室），操作前用75%乙醇擦拭台面，紫外线照射30分钟。

二、基本操作技术

（一）移液操作

移液是最基础但最易出错的环节，需根据量程选择合适移液器（0.1-10μL、10-100μL、100-1000μL）。操作时保持移液器垂直，吸液时缓慢按下至第一档，尖端浸入液面2-3mm（避免过深导致挂液），停留1秒后缓慢释放；放液时贴壁按下至第二档，确保液体完全排出，最后用吸水纸轻拭尖端（避免触碰吸头内壁）。需特别注意：高粘度液体（如甘油）或易挥发液体（如氯仿）需采用“反向移液法”——按下至第二档吸液，放液时仅按至第一档，减少残留误差。

（二）离心操作

离心的核心是根据目标分子特性选择转速与时间。例如分离细胞碎片（低速离心）通常800-1500×g，5-10分钟；沉淀质粒DNA（高速离心）需12000×g，10分钟；分离细胞器（超速离心）则需100000×g以上，1-2小时。离心管需对称放置，若样本量不足，可用等体积平衡液（如PBS）补足。离心后需缓慢打开离心机盖，避免液体震荡（如RNA提取时，剧烈震荡可能导致RNA酶污染）。

（三）电泳技术

电泳是分离核酸/蛋白质的核心技术，需根据目标分子大小选择凝胶类型。核酸分离常用琼脂糖凝胶（浓度0.5%-2%，分子越大浓度越低），制胶时需注意：琼脂糖完全融化后冷却至50-60℃再加EB（溴化乙锭）或GoldView（减少毒性），避免高温导致染料降解；胶板需水平放置，梳子与底板距离1-2mm（防止加样孔底部破裂）。上样时每孔加样量不超过凝胶孔体积的80%（避免溢出污染相邻孔），电泳缓冲液需淹没凝胶1-2mm，电压设置为5-10V/cm（凝胶长度），时间30-60分钟（至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶2/3处）。

蛋白质分离常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS），分离胶浓度根据蛋白分子量选择（10%-15%分离10-100kDa蛋白）。灌胶时需确保分离胶与浓缩胶界面平整（可用无水乙醇压平），聚合时间需严格控制（分离胶聚合约40分钟，浓缩胶约20分钟）。电泳时恒压80V（浓缩胶阶段）至120V（分离胶阶段），结束后用考马斯亮蓝R250染色（37℃摇床1小时），脱色液（10%乙酸+50%甲醇）脱色至背景清晰。

三、常见实验项目详解

（一）基因组DNA提取（以动物组织为例）

1.样本处理：取50-100mg组织（如肝脏），PBS冲洗去除血液，剪碎后加入1mL裂解液（100mMTris-HClpH8.0，50mMEDTA，0.5%SDS，200μg/mL蛋白酶K），55℃水浴消化3小时（期间轻柔颠倒混匀），至溶液澄清。

2.蛋白去除：加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），温和颠倒10次（避免剧烈震荡导致DNA断裂），12000×g离心10分钟，