CN119286993A 用于即时核酸检测的组合物和方法 （武汉大学）.docxVIP

(19)国家知识产权局

(12)发明专利申请

(10)申请公布号CN119286993A(43)申请公布日2025.01.10

(21)申请号202411221632.0

(22)申请日2022.01.07

(66)本国优先权数据

PCT/CN2021/0709632021.01.08CN

(62)分案原申请数据

202280002216.42022.01.07

(71)申请人武汉大学

地址430072湖北省武汉市武昌区珞珈山

(72)发明人殷昊芦舒涵张楹佟晓晗张坤周溪张定宇

(74)专利代理机构上海弼兴律师事务所31283专利代理师水文钰王卫彬

(51)Int.CI.

C12Q1/6844(2018.01)

C12N9/22(2006.01)

权利要求书5页说明书28页序列表(电子公布)附图26页

(54)发明名称

用于即时核酸检测的组合物和方法

(57)摘要

CN119286993A提供了用于简单、无仪器且灵敏的方法的组合物和方法，该方法能够对目的核酸分子进行快速、即时检测。这基于一个令人惊讶的发现，即扩增及基于CRISPR的切割和检测的相对效率可以调整为利于扩增，直到生成足够的扩增产物实现检测。示例方法包括设计向导RNA和引物以靶向非最优PAM序列，或序列工程化Cas核酸酶以降低其在与该向导

CN119286993A

CN119286993A权利要求书1/5页

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1.一种用于检测靶多核苷酸的方法，所述方法包括在如下混合物中孵育所述靶多核苷酸，所述混合物包含(a)聚合酶、(b)脱氧核苷三磷酸(dNTP)、(c)用于扩增所述靶多核苷酸的引物、(c)CRISPR相关(Cas)核酸酶、和(d)包含与所述靶多核苷酸上的靶片段互补的间隔片段的向导RNA,所述孵育在使得所述聚合酶有效扩增所述靶多核苷酸，同时所述Cas核酸酶能够切割经扩增的靶多核苷酸的条件下进行。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述向导RNA的靶片段包括或邻近可由所述Cas核酸酶识别的原型间隔子邻近基序(PAM)序列，所述PAM序列为次优的。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述PAM序列不是经典的。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述Cas核酸酶为LbCas12a,并且所述PAM序列选自由以下组成的组：NTTV、TNTV、TTNV、TTNT、VTTT、TVTT、VVTT、VTVT、VNVV、NVNV、NVVV、VNTV、NTVV、TNVV、YYYN和VVNV,其中N表示任何核苷酸。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述Cas核酸酶为AapCas12b,并且所述PAM序列选自由以下组成的组：VTN、TTN、TVN、NVN和VVN,其中N表示任何核苷酸。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中至少一个dNTP经修饰。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述修饰为用选自由以下组成的组进行的：磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯和甲基。

8.如权利要求6所述的方法，其中至少一个dNTP被替换为如下或所述引物中的至少一个核苷酸如下：脱氧尿苷三磷酸、脱氧肌苷三磷酸、假尿苷三磷酸、甲基假尿苷三磷酸、2-氨基嘌呤、5-溴dU或核糖核苷三磷酸(rNTP)。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述rNTP经修饰。

10.如权利要求8或9所述的方法，其中所述修饰为用选自由以下基团组成的组进行的：磷酰基、生物素、地高辛、氨基、硫醇、硫代磷酸酯和甲基。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包含包括所述间隔片段的截短的或5/3DNA-/RNA-延伸的CRISPRRNA(crRNA)。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述间隔片段为19个核苷酸或更短，优选18、17、16、15、14、13、12、11、10个核苷酸或更短。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中所述截短的或延伸的crRNA包括截短的或延伸的发夹结构序列。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括截短的反式激活crisprRNA(tracrRNA)序列。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述向导RNA包括与所述间隔片段或所述发夹的至少一部分互补的区域。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述间隔片段中的至少一个核苷酸不是标准核糖核苷酸，其优选位于所述间隔片段中的核