莲藕多酚氧化酶的研究.doc

【标题】莲藕多酚氧化酶的研究 【作者】李鹏 【关键词】莲藕??多酚氧化酶??抑制剂??底物专一性??褐变度 【指导老师】何士敏 【专业】生物科学 【正文】1?引言多酚氧化酶(PolyPhenol oxidase，简称PPO)是植物体内普遍存在的一种酚氧化酶。主要分为三类：单酚氧化酶[酪氨酸酶(Tyrosinase)，Ec.l.14.18.l]、双酚氧化酶[儿茶酚氧化(eateehnoloxidase)，Ee.l.lo.3.2]、漆酶[(Laeease)，EC.l.10.3.1]。现在所说的多酚氧化酶一般是指儿茶酚氧化酶和漆酶的统称。1973年，Kubowitz在Warburg实验室中第1次分离出多酚氧化酶。此后，对多酚氧化酶的研究不断地深入，多酚氧化酶的应用也不断地扩大。多酚氧化酶是植物体内普遍存在的一类铜结合酶。能催化多酚类氧化成醌类，醌再聚合成有色物质，从而引起植物的褐变。酶促褐变与果蔬加工、组培成功以及植物的抗病性等密切相关，因此对于多酚氧化酶的研究有重要的实用价值[1]。目前国内外对于多酚氧化酶的研究已经有一定的深度，现已达到分子水平。分析表明，PPO是一种质体酶，存在于正常细胞的质体内。PPO相当稳定，甚至在土壤中已腐烂的植物残渣上都可检测到PPO的活性。研究表明,有活性的PPO定位于正常细胞的质体中。叶绿体的PPO存在于类囊体上，其它类型质体的PPO存在于各种囊泡上。定位于类囊体的PPO究竟是结合于类囊体膜上，还是溶解在膜腔中，目前尚无定论。虽然几乎所有的质体中都包含PPO，但在某些组织中很难检测到PPO活性：例如C4植物的维管束鞘细胞和保卫细胞的质体。国内外主要对苹果、马铃薯?、茶叶?、烟草?、小麦、甘蔗等研究得较多。对PPO在细胞中的定位、分子结构特点、基因、进化、生理功能及其影响因素进行了大量的研究。通常情况下，位于类囊体膜上的PPO是处于潜伏状态的，用去污剂或亚油酸可解除其潜伏性。当衰老或其它因素影响时，会引起PPO活性的变化。现在通过遗传定位和转基因方法，通过下调PPO的表达以有效地防止褐变，上调PPO表达则能提高植物的抗病性。现已成功地在苹果芽的外植体、马铃薯块茎中转入外源PPO基因。尽管前人已做了大量的工作，至今仍有许多问题不清楚：如PPO的亚细胞定位，三维结构，PPO活性与前体的酶解的联系，Cu2+是否与PPO前体和中间体结合，在催化反应中Cu2+是否变价，PPO在光合系统中的作用等[2]。PPO自发现以来一直是研究的热点。国外对PPO的研究已相当深入，尤其是在PPO的生化、生理学性质方面近年来取得了较大的进展，但在结构和功能方面的研究进展相当缓慢，许多问题仍相当模糊，这方面的研究将是下一阶段研究的主要方向。莲藕( Lotus root)为多年生宿根性草木植物，属睡莲科。在长江流域、珠江二角洲、洞庭湖区有悠久的栽培历史，资源十分丰富。莲藕富含糖类、蛋白质、维生素、矿物质等营养成分，汁多肉嫩，风味独特[3]。但莲藕不耐贮藏和运输，易发生褐变而影响莲藕的品质。莲藕褐变的主要原因是组织中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase EC1. 10. 3. 1. PPO)将酚类物质氧化成醌，醌再聚合成有色物质，因此莲藕的护色关键在于抑制酶促褐变反应。通过对莲藕中多酚氧化酶性质的研究，确定了多种抑制PPO活性的方法，以期在生产实践中，为莲藕护色保鲜工艺提供技术参数。?关于莲藕多酚氧化酶的研究目前国内外很少有报道。本次研究系统研究了底物浓度、pH、温度以及抑制剂对其PPO酶的影响，旨在为鲜切莲藕生产中的防褐、保鲜提供技术参数及理论依据[4]。2?实验材料与方法2.1实验材料市售莲藕：马鞍镇售带泥莲藕，洗净后挑选组织完整、无损伤、无变色莲藕供试验用；底物：邻苯二酚；缓冲液：pH3.0甘氨酸-盐酸缓冲溶液，pH4.0的醋酸钠缓冲溶液，pH5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸盐缓冲溶液， pH9.0、10.0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液；测定所用的主要仪器是：紫外可见分光光度计（型号：U—1800）,高速冷冻离心机2.2实验方法2.2.1? PPO酶液的提取新鲜莲藕洗净、去皮、擦干。称取5g放入研钵，加入15mL pH 7.0的磷酸缓冲液，加少许石英砂，冰浴研磨。然后用磷酸缓冲液定容至100mL。转入离心管，6000r/min冷冻离心15分钟。取其上清液即为酶液[5]。2.2.2? PPO活性的测定先将1mL 0.2mol/L的邻苯二酚溶液加入1cm厚度的玻璃比色皿。再将2mL粗酶液加入到4ml 0.2mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液混合。然后取出1.5mL迅速注入到已加了邻苯二酚的比色皿（余下的4.5mL重复同样的实验）室温（约20℃左右）下波长为420nm