肿瘤药理学研究方法.pptVIP

肿瘤药理学研究方法概述 药理学研究方法的演进 药理学研究方法，通常是以各种生理生化方法为基础的。 随着生命科学的发展，药理学研究从整体，发展到组织、细胞和分子水平。 现代分子生物学的发展，为药理学研究提供了更丰富的手段。 肿瘤药理学研究常规方法 整体水平：荷瘤小鼠（瘤体生长、转移）； 细胞水平：细胞增殖（MTT）、分化（形态、酶学）、凋亡（形态、流式细胞计数）； 分子水平：蛋白表达（Western, 流式细胞计数），蛋白活性（ 酶学、转运），DNA扩增、变异（Southern、PCR），mRNA表达（Northern, RT-PCR）。 转录调控研究方法在药理学中的应用 肿瘤的发生和发展，与肿瘤细胞的基因变异和表达异常有密切关系。针对肿瘤细胞特异性的基因表达异常，可能发现有特异性作用的抗肿瘤药物。 基因表达调控，是现代生物医学研究的前沿领域。 DNA转录形成RNA，RNA翻译形成蛋白质，这一过程称为基因表达。 基因表达的调控，可以发生在各个水平上 。 RNA转录的有关理论 基因5‘非编码区含有转录起始区和相应基因序列，称为启动子。 启动子由三类DNA序列组成，一类是基础（或核心）启动子单元，一类是启动子近端单元，一类是启动子远端单元。 典型的核心启动子单元是由TATA盒（位于转录起始点上游25bp左右）和嘧啶富含区单元（转录起始点）组成，它们是PolII的主要DNA靶点。 启动子近端单元通常位于转录起始点上游50－200bp 。 启动子远端单元则可位于转录起始点上游或下游的不同距离的区域。 转录因子与它们结合，调节PolII的活性，影响转录起始过程。 转录调控是通过影响在起始、延长、终止过程中PIC的组装和催化效率来达到的。在起始阶段PIC的组装，是整个转录过程的限速环节。 转录因子 不同基因的表达是通过一个复杂的调控网络调节的，在这一网络中，特定的转录因子将信号传递给特定的靶基因。 外界刺激信号通过信号转导通路，经过一系列酶促反应，影响相应的转录因子，最终引起相关基因的改变，产生一定的生物学效应。 多数转录因子是DNA结合蛋白，结合于靶基因的调节DNA元件，或称为顺式作用元件（cis-acting element）。 转录因子也称为反式作用因子（trans-acting factor）。 哺乳类细胞大约含有2－3千种转录因子，有限数量的转录因子，是通过组合效应来实现对其自身和其它基因表达调控的。 组合效应：三种转录因子及其DNA结合序列，通过不同的排列组合，可产生九种调节方式。 转录因子一般有两个特征性的功能簇，一个是DNA结合功能簇，可与基因的特定调节位点，即顺式调节单元直接结合； 另一个功能簇则显示转录激活或抑制活性。 有时，这两个功能簇也可位于不同的蛋白分子上，共同形成分子伴侣。 转录调控研究的常用方法 转录调控研究可分为两类，既蛋白质与DNA的相互作用，和蛋白质与蛋白质的相互作用。 蛋白质与DNA的相互作用 DNA足印法 这是一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，可保护所结合的DNA区域不受DNase I 或其它分子的消化。通过比较转录因子存在与否时，消化的DNA条带分布，可以了解转录因子所结合的具体DNA序列。 应用示例 拓扑异构酶IIα是肿瘤治疗的一个重要靶点。肿瘤细胞的拓扑异构酶II表达下降，可能是其对该类细胞毒性药物产生抗性的机理。 Hoechst 33342是合成的化合物，可促进拓扑异构酶II的表达，可能作为克服肿瘤抗药性的辅助化疗药物。 Western Blot：与对数生长期（1）相比，生长停滞期的细胞（2）的拓扑异构酶IIa表达明显下降。Hoechst 33342处理（3）可恢复生长停滞期的细胞（2）拓扑异构酶IIa表达。 DNase I 足印：Distamycin A（a）和Hoechst 33342 (b)可单独产生DNA足印，Distamycin A 的DNA结合作用比Hoechst 33342 更广泛。Hoechst 33342 主要结合于ICB2的位置。(c)核蛋白可与Hoechst 33342 竞争结合ICB2的位置。ICB1和2显示拓扑异构酶IIa基因启动子上CCAAT序列位置。 足印法结果显示， Hoechst 33342能结合于拓扑异构酶II的启动子DNA区域，而可能抑制有关转录因子与其相应DNA结合位点的结合。 Hoechst 33342 的竞争性结合序列主要是ICB2，这是一个已知的拓扑异构酶IIa启动子抑制区。 凝胶延迟实验 凝胶延迟实验也称Gel Shift或Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 。 是另一种直接观