人质子感知受体TDAG8基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染293T细胞.docVIP

  人质子感知受体 TDAG8 基因的克隆、表达 载体构建及瞬时转染 293T 细胞# 杨德志，李敏，马强，冯文利，阿拉坦高勒** 5 10 15 20 25 （内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021） 摘要：克隆人质子感知受体 TDAG8 基因、构建 TDAG8 基因的表达载体并瞬时转染 293T 细胞， 检测 TDAG8 的表达。从人胃癌组织 cDNA 中克隆 TDAG8 基因，亚克隆到 pEASY-T1 载体，通过 测序、酶切、连接到表达载体 pEGFP-N3，测序鉴定获得 pEGFP-N3-TDAG8 重组质粒；表达载 体以 lipofectamine2000 介导转染 293T 细胞。Real time PCR 法检测外源基因在 293T 细胞 中的表达。结果表明：克隆到了 TDAG8 基因并获得了 pEGFP-N3-TDAG8 表达载体,在 293T 细 胞中检测到了过表达 TDAG8 基因。 关键词：TDAG8；基因克隆；瞬时转染；293T 细胞 中图分类号：Q291 Human Proton-sensing Receptor TDAG8 Cloning、 Construction of Expression Vector and Transient Transfection into 293T Cells Yang Dezhi, Li Min, Ma Qiang, Feng Wenli, Alatan Gaole (College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Huhhot 010021) Abstract: We cloned human proton-sensing receptor TDAG8, constructed TDAG8 expression vector and transiently transfected into 293T cells then detected the expression of TDAG8. TDAG8 was cloned from human gastric cancer cell cDNA, and then sub-cloned into pEASY-T1 carrier. By sequencing, digestion and ligation, TDAG8 was cloned into the expression vector pEGFP-N3, DNA sequencing used to confirm pEGFP-N3-TDAG8 recombinant plasmid; the plasmid was transfected into 293T cells with lipofectamine2000. Real time PCR assayed the exogenous TDAG8 expression in 293T cells. In conclusion, we clonedTDAG8 gene and constructed pEGFP-N3-TDAG8 expression vector, in addtion TDAG8 gene was over-expressed in 293T cells were observed. Keywords: TDAG8; Gene cloning; Transient transfection; 293T cell 30 0 引言 T 细胞死亡相关受体 8（TDAG8）是 G 蛋白偶联受体家族，OGR1 亚家族（包括 OGR1,G2A,TDAG8,GPR4）成员，在 T 淋巴细胞程序性死亡过程中高表达，并可能参与活 化诱导 T 细胞死亡[1,2]。人 TDAG8 基因位于 14 号染色体 q31–32.1 区，全长 1787 bp，一个 35 40 外显子，两个内含子，外显子长 1014 bp，编码 337 个氨基酸[3]。Im 等 2001 年鉴定了 psychosine （鞘氨醇半乳糖苷）为 TDAG8 的脂质配体，以及 psychosine 结构类似溶血磷脂也能够活化 TDAG8[4]。王等在 2004 年报道了 TDAG8 为质子配体，TDAG8 能够感知细胞外酸性（pH） 从而激活细胞内信号通路[5]。随着对 TDAG8 介导的信号转导通路的深入研究发现，TDAG8 可能参与炎症反应以及肿瘤的生成与发展过程[6,7]；为进一步研究 TDAG8 怎样参与炎症反应 与肿瘤的发生、发展等问题，本研究中克隆了 TDAG8 基因并构建表达载体，瞬时转染细胞， 基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（2009