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第二节 凝胶过滤层析 图7-6 GFC的分离原理及洗脱曲线 GFC操作中溶质的分配系数M只是相对分子质量、分子形状和凝胶结构(孔径分布)的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关，即在一般的层析操作条件下、相对分子质量一定的溶质的分配系数为常数。因此，GFC操作一般采用组成一定的洗脱液进行洗脱展开，这种洗脱法称为恒定洗脱法(isocratIc elution)。 2．凝胶层析的操作 （1）凝胶的处理 葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶上以干品出售的，所以在使用前必须溶胀。可以将它们浸泡在洗脱剂中，慢慢搅拌。洗脱剂应具有一定的离子强度（约为0.08）。 （2）装柱 装柱前，柱的底部要先放些玻璃棉、玻璃细孔板等可拆卸的支持物，以支持固定相。凝胶要悬浮在洗脱剂中，在搅拌下缓慢加入柱中，使凝胶自然沉积，直到所需高度为止。床层要均匀，不能有纹路或气泡。装柱时要考虑凝胶的承压能力，如压力太高，凝胶会被挤压变形而影响流速。 （3）上样和洗脱 柱床经洗脱剂平衡后，在床顶部留下数毫升洗脱剂，再用滴管轻轻沿柱壁将试样加入至柱的上面，防止扰动填充层表面，打开柱底部的流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，加入数毫升洗脱剂冲洗管壁。这一步关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶表面干燥而发生裂缝。然后用大量洗脱剂洗脱，并收集相应的洗脱液。 非水溶性物质的洗脱采用有机溶剂（如苯和丙酮），水溶性物质的洗脱一般采用水或具有不同离子强度和pH的缓冲液。PH的影响与被分离物质的酸碱性有关，在酸性pH时碱性物质易于洗脱，在碱性pH时酸性物质易于洗脱。多糖类物质的洗脱以水为最佳，有时为了使样品溶液解度增加而使用含盐洗脱剂。 （4）凝胶的再生和保养 理论上因为凝胶本身不与溶质发生作用，所以层析分离后无需再生处理，但实际操作时凝胶层常有一定的污染，必须作适当的处理。交联葡萄糖凝胶柱可用0.2mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl混合液处理，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶由于遇酸、碱不稳定，常用0.5mol/L NaCl处理。 为了抑制微生物在凝胶层内生长，在凝胶床保存之前必须完全除去磷酸根离子和所有底物，将柱真空保存或低温保存，但温度不可过低，离子强度要高一些，以防冻结。经常使用的凝胶以湿态保存为主，只要在其中加入适当的抑菌剂就可放置几个月至一年，不需要干燥。常用的抑菌剂有：叠氮钠（0.02%）、三氯丁醇（0.01%～0.02%）、乙基汞硫代水扬酸钠(0.005%～0.01%)、苯基汞代盐（包括、苯基汞代乙酸盐、硝酸盐、硼酸盐，0.001%～0.01%）。 3．凝胶过滤介质 凝胶过滤层析常用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。因此，良好凝胶过滤介质应满足以下要求： ①亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； ②稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长； ③具有一定的孔径分布范围； ④机械强度高，允许较高的操作压力(流速)。 商品化的凝胶过滤介质除部分机械强度较高外，大部分为软凝胶，耐压能力较低，但均能满足上述①～③项的要求。 其中Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖(右旋糖酐)交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。原料中环氧氯丙烷用量越大，交联度越高，凝胶的网状结构越紧密，吸水量越小。Sephadex凝胶按交联度大小，分Gl0～G200共八种型号。图7-7为交联葡聚糖的网状结构示意图，其中曲线表示葡聚糖凝胶骨架。 图7-7交联葡聚糖网状结构 图7-8琼脂糖凝胶结构 琼脂糖凝胶是另一种较常使用的凝胶过滤介质，其骨架结构如图7-8所示。 第二节 凝胶过滤层析 Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度较低。Sepharose CL是利用环氧氯丙烷交联制备的琼脂糖凝胶，机械强度较普通Sepharose高。除GFC外，琼脂糖凝胶经化学修饰后主要用于离子交换层析、疏水性相互作用层析及亲和层析的载体。 除上述两种常用的凝胶外，聚丙烯酰胺凝胶也常使用。 二、凝胶层析的应用及特点 1．分离纯化 GFC可用于相对分子质量从几百到l06数量级的物质的分离纯化，是蛋白质、肽、脂质、抗生素、糖类、核酸以及病毒(50 nm ～400nm)的分离与分析中频繁使用的液相层析法。 图7-9