腺病毒介导凋亡素基因对胃癌细胞的影响.pdfVIP

摘 要 目的：构建携带有凋亡素基因的重组腺病毒载体，探讨其对胃癌细胞及小鼠实验性胃癌 的致凋亡作用。 方法：将凋亡素基因克隆入腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV 中，构建出重组穿梭质粒 pAdTrack-CMV-VP ，与腺病毒骨架质粒 pAdEasy-1 共同转化大肠杆菌 BJ5183 ，将获得的 3 重组质粒 pAd-VP3 经 pacI 线性化后转染 HEK293 细胞，包装出病毒颗粒。对重组腺病毒进 行鉴定、纯化、测定滴度。通过 RT-PCR 、荧光染色及流式细胞等技术，观察胃癌细胞中 凋亡素基因的表达及其致凋亡作用。将小鼠前胃癌细胞注射入昆明小鼠腋部皮下建立胃癌 动物模型，实验组瘤内注射腺病毒 Ad-VP ，对照组瘤内分别注射腺病毒Ad 和 PBS ，隔日 3 测量肿瘤体积及观察有无不良发应，注射后 15 天处死小鼠计算抑瘤率。取肿瘤组织用 TUNEL 法检测 VP3 的致凋亡作用。取同一直径的荷瘤小鼠用不同的病毒滴度注射和取不 同直径的荷瘤小鼠用相同的病毒滴度注射，观察抑瘤效果。 结果：酶切和测序鉴定结果显示，凋亡素基因被正确克隆到腺病毒穿梭质粒 pAdTrack-CMV 中，并成功构建了携带凋亡素基因的重组腺病毒质粒 pAd-VP 。将其线性 3 化后转染 HEK293 细胞，成功包装出重组腺病毒 Ad-VP 。经PCR 检测显示 VP 基因被正 3 3 11 确克隆入腺病毒基因组中，测定病毒滴度为10 pfu/ml。Hoechst33258 染色显示被 Ad-VP3 感染的胃癌细胞出现凋亡形态学改变，RT-PCR 检测显示被 Ad-VP3 感染的胃癌细胞表达 VP3 基因的 mRNA ，用流式细胞仪测定最高凋亡率达 51.7％。小鼠实验性胃癌内注射 Ad-VP3 后，肿瘤体积较对照组明显缩小（P 0.05 ）。TUNEL 法检测显示注射 Ad-VP3 的肿 瘤细胞出现典型的凋亡小体和核固缩。肿瘤体积越小，腺病毒用量越大，疗效越好。 结论： 成功包装出了携带凋亡素基因的重组腺病毒 Ad-VP ；Ad-VP 感染胃癌细胞后，能 3 3 有效诱导胃癌细胞凋亡；Ad-VP3 对小鼠实验性胃癌有较好的抑瘤作用。 关键词：凋亡素；腺病毒载体；凋亡；胃癌细胞；胃癌模型。 I Abstract Objective: To construct recombinant adenovirus vector carrying VP gene and to investigate 3 the effects of VP gene on gastric cancer cell and mouse experimental gastric cancer . 3 Methods: VP3 gene was cloned into adenovirus shuttle plasmid pAdTrack-CMV ,then the resultant plasmid pAdTrack-CMV-VP3 was cotransformed into E.coli BJ5183