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暨南大学硕士论文 RIP2 对大肠杆菌的抗菌作用及其机制研究 RIP2 对大肠杆菌的抗菌作用及其机制研究 摘要 目的 受体相互作用蛋白 2(receptor-interacting protein 2, RIP2)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在 信号转导途径中起关键作用，作为 NOD 样受体(NOD-like receptors, NLRs)信号通路的下 游因子，衔接 NLRs 并激活 NF- κB 信号传导通路，在先天性免疫反应和清除病原体感染 的炎症反应中起着重要作用。肠道细菌感染是临床实践中最常见的细菌感染之一，在其感 染过程中可以被宿主 NLRs 识别，并通过 RIP2 信号分子激活细胞核内转录因子 NF- κB 的转录，并表达各种炎性细胞因子，从而引发宿主的多种防御机制。蛋白激酶-丝裂原活 化蛋白激酶信号通路参与细胞的生长发育及细胞间各种功能等生理过程，其中 p38MAPK 主要参与炎症反应和应激反应。本研究将构建的 RIP2 基因转染至肠道细胞后，RT-PCR 和 Western blot 检测观察 mRNA 转录水平和蛋白表达水平；将大肠杆菌感染已转染 RIP2 的 SW480 细胞，计数细胞胞内细菌数量变化；应用 p38 MAPK 通路抑制剂 SB203580 作 用于各实验组细胞，计数胞内大肠杆菌活菌数的变化；并用 Western blot 法检测各实验组 磷酸化 p38 表达水平，观察 RIP2 清除大肠杆菌的作用同 p38MAPK 信号通路的关系。 方法 本实验用阳离子聚合物 JetPeiTM 将人 RIP2 基因(pEGFP-C2-PIP2)转染至人结肠癌 SW480 细胞株，以转染空质粒(pEGFP-C2-PIP2)及未转染的 SW480 细胞株作为对照组， 应用 RT-PCR 和 Western blot 法检测细胞外源性 RIP2 mRNA 和 RIP2 蛋白的表达；并用 LB 培养基培养大肠杆菌 ATCC25922 ，收集细菌后用紫外分光光度计于 600nm 波长测定 其 OD 值，将其绘制曲线后确定细菌浓度；按一定比例将活菌感染 SW480 细胞，分别在 不同的时间点内 （4h 、24h 、36h ）用 TritonX-100 裂解细胞，裂解液涂布细菌平板培养， 计数菌落并观察大肠杆菌菌落数的变化；用大肠杆菌刺激已转染 RIP2 、转染空质粒和未 转染质粒的 SW480 细胞 24 小时，平板培养菌落观察 3 组组间大肠杆菌活菌数的变化；应 用 p38 MAPK 通路抑制剂 SB203580 作用于实验组细胞，与未加抑制剂各组细胞相比较， 计数胞内大肠杆菌活菌数的变化；用 Western blot 法观察转染 RIP2 及细菌刺激前后细胞 内磷酸化p38 蛋白表达量。 I 暨南大学硕士论文 RIP2 对大肠杆菌的抗菌作用及其机制研究 结果 与对照组相比，转染 RIP2 组其 mRNA 转录水平和蛋白表达水平均明显升高 （P0.01, P0.05 ），表明 RIP2 表达质粒成功转染 SW480 细胞；大肠杆菌感染 SW480 细胞后，随着 时间的推移，胞内的大肠杆菌数量也随之增长，说明大肠杆菌在 SW480 细胞内的生长呈 增加趋势；将大肠杆菌刺激细胞 24h 后，转染 RIP2 细胞组的活菌数较转染空质粒组和未 转染质粒组胞内活菌数数量明显减少，其差异有统计学意义 （P0.01 ），说明转染 RIP2 的 SW480 细胞能清除胞内大肠杆菌；而加入 SB203580 阻断p38 MAPK 信号通路后，转 染 RIP2 细胞组内活菌数量增加；并且转染 RIP2 组磷酸化 p38 蛋白表达量明显高于转染 空质粒的对照组组，转染 RIP2 组间用大肠杆菌刺激后细胞磷酸化 p38 蛋白表达量高于未 用细菌刺激的对照组，并且高于转染空质粒的对照组；而加入 p38MAPK 通路抑制剂 SB203580 后 p38 蛋白表达量减少。 结论 1. RIP2 质粒成功转染 SW480 细胞，且 mRNA 转录水平较对照组明显增高