RNA干扰CRMP5抑制大鼠海马神经元突起生长.pdfVIP

中文摘要 目的：筛选干扰坍塌反应调节蛋白 5 （Collapsin response mediator protein 5， CRMP5 ）mRNA 的有效 siRNA 序列，探讨 CRMP5 对大鼠海马神经元突起生长 的影响。 材料和方法：首先通过PCR 筛选有效干扰 CRMP5 基因mRNA 表达的 siRNA， 然后化学合成有效 siRNA 序列，并在 siRNA 序列 5端标记荧光基团 FAM ，脂质 体瞬时转染原代培养大鼠海马神经元，荧光显微镜下观察绿色荧光在神经元内的 表达部位及神经元突起生长。 结果：（1）脂质体法将FAM 标记的阴性对照 siRNA 瞬时转染大鼠海马神经元， 流式细胞仪检测转染效率为34.3% 。（2）化学合成四对针对CRMP5 基因的siRNAs 序列，通过 RT-PCR 成功筛选出两对有效 siRNAs，实时荧光定量PCR 进一步筛 出一对相对有效 siRNA 。共聚焦显微镜观察结果显示CRMP5 均匀分布于神经元 胞体、突起以及生长锥，标记二抗显示实验组 CRMP5 表达较对照组弱。（3 ）脂 质体法瞬时转染后，FAM 标记的 siRNAs 分布于神经元胞体、突起和生长锥，有 效 siRNA 干扰后的神经元细胞形态发生改变，突起及分支较空白对照组短，且 随着时间的推移，细胞突起较对照组生长缓慢，分支较对照组明显减少，部分阳 性细胞只有一级突起。不同时间点上神经元一级和二级突起长度 siRNA 组较对 照组有统计学意义。 结论：（1）成功把siRNAs 转染入原代培养大鼠海马神经元。（2 ）成功筛选出 一对有效干扰 CRMP5 基因 mRNA 的 siRNA 。（3 ）CRMP5 表达于海马神经元的 胞体、突起和生长锥。（4 ）siRNA 抑制 CRMP5 后，神经元突起回缩塌陷，且初 级和次级突起数目明显减少，说明干扰 CRMP5 后能抑制突起生长。 关键词：坍塌反应调节蛋白 5，RNA 干扰，突起，生长，神经元，海马，大鼠 I ABSTRACT Objective: To select an effective siRNA that interfer with CRMP5 mRNA, and investigate positive effect of CRMP5 gene on neurite outgrowth in rat hippocampal neurons. Materials and methods: After selecting an effective siRNA that interfered CRMP5 gene by PCR, the effective siRNA sequence was acquired via chemical synthesis, and fluorescence radix FAM was constructed upon 5′terminal of the siRNA. The siRNA was then transiently transfected into hippocampal neurons with lipofection reagent. The localization of FAM and neurite outgrowth of hippocampal neurons were observed by fluorescence microscope. Results: (1) The negative control FAM-siRNA was transfected successfully with lipofection reagent and transfection efficiency tested by Flow cytometry came up to 34.3%. (2) Four siRNAs sequence were obtained via