登革病毒复制子反式包装系统的建立.pdfVIP

中文摘要 目的： 利用反向遗传学操作构建登革病毒复制子的反式包装系统；在此基础上，制 备登革病毒单轮感染性颗粒，为登革热新型疫苗的研究奠定基础。 方法： 1. 在登革 1 型病毒广州分离株基因组全长感染性克隆的基础上，利用重叠 PCR 扩增获得病毒基因组 5’端与 GFP 融合片段，将其插入病毒基因组中以替换病 毒的绝大部分结构基因，并获得带有 绿色荧光蛋白的病毒复制子 DV1-EGFP-RP 。同步构建其致死性突变复制子DV1-EGFP△GDD -RP 作为对 照。通过报告基因和 RT-PCR 的方法鉴定病毒复制子的复制特性。 2. 利用重叠 PCR 扩增获得 DV/JEV 嵌合型 prME 片段，将其插入 pcDNA3.1 质 粒构建相应真核表达载体，转染 BHK21 细胞后，通过 RT-PCR 和免疫荧光鉴 定登革病毒 prME 的胞内表达特性。利用超速离心对上清中的病毒样颗粒进 行纯化，通过电镜和 western blot 对其进行鉴定。 3. 为制备获得复制子包装颗粒，首先将病毒复制子 RNA 电转BHK-21 细胞后， 再利用脂质体转染方法将辅助包装质粒导入细胞，以使病毒结构和非结构蛋 白共表达于宿主细胞中。利用超速离心获得细胞培养上清中的病毒样颗粒， 利用 RT-PCR 、western blot 方法对其复制子包装颗粒的生化组分进行鉴定。 最后将该病毒样颗粒接种 BHK-21 细胞，明确其单轮感染性特征。 结果： 1．获得了高效表达的含绿色荧光蛋白报告基因的登革病毒复制子载体。 2 ．成功构建了登革病毒prME 嵌合质粒 pcDV/JEV prME ，并制备了分泌性病毒 样颗粒。 3 ．制备了具有单轮感染性的登革病毒病毒样颗粒。 结论： 成功建立了基于登革病毒复制子的反式包装系统，制备了具有单轮感染性的 I 病毒样颗粒，为下一步的研究工作打下良好的基础。 关键词：登革病毒，复制子，病毒样颗粒，反式包装，单轮感染性 II ABSTRACT OBJECTIVE We developed the dengue virus replicon-based trans-packaging system by the use of reverse genetics operations. Then dengue virus single-round particles were produced in the system we have established. METHODS 1. On the base of DV1 GZ-06 cDNA, dengue virus 5’ terminal genome and GFP gene were fused together by overlap PCR technique first. Then the fusion gene was inserted into the corresponding region of dengue virus genome and replaces most of the structural gene to constructed dengue virus replicon with GFP gene reporter (DV1-EGFP-RP). In order to set up a matched control a lethal mutation replicon (DV1-EGFP△GDD -RP) was constructed at the same time. The replicons were further detected and characterized by reporter gene system and RT-PCR, respectively. 2. DV/JEV chimeric prME gene sequence was