低氧条件下ROS促进脑胶质瘤细胞迁移和AQP1表达及其机制的研究.pdfVIP

低氧条件下 ROS 促进脑胶质瘤细胞迁移和 AQP1 表达及其机制的研究 摘 要 研究背景及目的： 低氧微环境是实体肿瘤的病理生理学特点之一，在适度低氧的微环境下，活 性氧（reactive oxygen species ，ROS ）的堆积可能会引起肿瘤细胞的的适应性反应。 神经胶质瘤是一种浸润性高、容易复发的肿瘤，研究低氧以及低氧状态下活性氧对 神经胶质瘤细胞迁移的影响具有重要的意义。 Aquaporin （AQP ）是一类存在于细胞膜上的水通透性蛋白，在哺乳动物各种组 织中广泛分布，目前已经成功克隆的哺乳动物水通道蛋白家族共有 13 个成员 (AQP0~AQP12) 。大量研究表明，它们在人体的液体转运过程中起重要作用，进而 参与多种器官的生理和病理过程。最近 Saadoun 等发现了细胞膜水通道蛋白在细胞 迁移中的重要作用，为水通道在肿瘤中的机制研究开辟了一个新的领域。有众多研 究证实了它的表达可能促进血管内皮细胞和肿瘤细胞的迁移，但是在不同的细胞种 类中水通道蛋白的作用还有争议，因此还需要在包括神经胶质瘤等更多不同种类的 肿瘤细胞中进一步验证。在 AQP 的家族中，AQP1 在脑胶质瘤的表达水平远大于正 常脑组织。以往的研究多集中在脑肿瘤诱发的脑水肿与 AQP1 的关系上，但是目前 看来 AQP1 对脑肿瘤的作用不仅仅局限于脑水肿上，而是多方面的。 基于以上研究背景，本实验的研究目的：研究低氧微环境下 ROS 对 AQP1 以 及胶质瘤细胞株迁移的调节，并探讨在这个过程中，AQP1 是否是低氧调节因子 HIF －）的下游靶基因。并通过 SWO-38 （hypoxia-inducible transcription factor －， 细胞中所克隆的恶性程度不同的两株细胞亚系 SWO-Z1 和 SWO-Z2 的比较，探讨低 氧环境下两株亚系细胞迁移以及 AQP1 表达的异型性。通过以上研究，探讨 AQP1 作为脑胶质瘤治疗的新靶点的可行性，并为进一步的体内研究打下基础。 主要研究内容及研究方法： 在第一部分里，以 SWO-38 细胞株中所克隆的恶性程度不同的两株细胞亚系 SWO-Z1 和 SWO-Z2 为研究对象，将实验分为常氧组、低氧组、低氧+SOD （SOD 为 ROS 特异性淬灭剂）组。建立一种能准确、动态、定量地监控活细胞中 ROS 产生 I 的化学发光法，检测低氧引起的 ROS 水平的改变；通过划痕实验和细胞穿孔实验 测定细胞迁移力探求低氧环境对细胞迁移力的影响；同过 ROS 特异性淬灭剂的加 入验证低氧条件下 ROS 与细胞迁移的关系；并比较低氧微环境下两株细胞亚系 SWO-Z1 和 SWO-Z2 的迁移率。 在第二部分里，运用反义寡核苷酸技术阻止 AQP1 的表达、应用AQP1 抑制剂 乙酰唑胺处理 SWO-38 细胞，用蛋白印迹的方法检测处理前后 AQP1 蛋白的表达； 并检测 AQP1 蛋白表达受抑制以后下列细胞生物学行为的改变：用划痕实验和细胞 穿孔实验测定细胞迁移力；MTT 法检测细胞增殖活力；贴壁实验检测细胞粘附力； 流式细胞仪检测细胞凋亡。从而探讨 AQP1 对 SWO-38 细胞迁移力等一系列生物学 行为的影响。 将实验分为常氧组、低氧组、低氧+SOD （ROS 特异性淬灭剂）组，用蛋白印 迹的方法检测各组 AQP1 的表达，并比较低氧微环境下两株细胞亚系 SWO-Z1 和 SWO-Z2 的AQP1 表达的异质性，探讨低氧环境否能通过调节 AQP1 蛋白的表达从 而促进细胞迁移；通过 HIF －的 RNA 干扰抑制 HIF －的的表达来观察 AQP1 蛋 白是否为HIF －的靶基因。 实验结果： 1. 第一部分实验中 低氧条件下细胞迁移的改变：倒置相差显微镜下观察到在低氧条件下划痕实验 和穿孔实验中，细胞的迁移力均增高；而低氧+SOD 组的细胞迁移力高于常氧组， 但是低于低氧组；常氧条件下，SWO-Z1 和 SWO-Z2 的细胞迁移力无显著差异，而 低氧条件下