海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化.pdfVIP

第 29卷第 5期 大 连 工 业 大 学 学 报 Vo1．29 NO．5 2010年 9月 JournalofDalianPolytechnicUniversity Sept．20 10 文章编号 20lO)O50317一O4 海参溶菌酶基因克隆及在毕赤酵母中的表达与纯化 谷 跃 峰 ， 丛 丽 娜 ， 骆 宁 (大连工业大学 生物与食 品工程学院，辽宁 大连 116034) 摘要：研究构建并筛选了具有抑菌活性的重组海参溶菌酶(Stichopusjaponicuslysozyme，SJI)的毕赤 酵母工程菌。从海参肠组织中提取总RNA，根据 已经测得的s-lL的基因序列(GenBankaccessionNo． EF036468)设计引物 ，以总 RNA 为模板经 RT—PCR获得 目的基 因，并将该基 因与表达载体 pPIC9K连 接 ，构建重组质粒 pPIC9K—SJI，再转化至毕赤酵母 GS115中。利用 MD、MM 和含抗生素 G418的YPD 平板培养基筛选 出表型为 HisMut的高拷贝阳性菌株 。挑选具有抑菌活性的菌株进行 甲醇诱导表达 液体发酵 ，其上清液经硫酸铵沉淀、透析后得到溶菌酶粗 品，再经 CM52纤维素阳离子交换柱进一步纯 化 ，得到 电泳纯的溶菌酶 。结果显示 ，共筛选到 7株有抑菌活性的重组酵母菌株 ，诱导 7’2h时表达量最 高。SJI在毕赤酵母 中得到成功表达。 关键词 ：海参溶菌酶 ；毕赤酵母；表达；纯化 中图分类号 ：TS254；Q786 文献标志码 ：A Cloningandexpressionoflysozymefrom Stichopusjaponicus inPichiapastoris GU Yue—feng， CONG Li—na， LUO Ning (SchoolofBiological FoodEngineering，DalianPolytechnicUniversity，Dalian116(334．China) Abstract：Theexpressionoflysozymefrom seacucumberStichopusjaponicusinPichiapastoriswas studied．ThetargetgenewasobtainedbyRT—PCR from thetotalRNA ofStichopusjaponicus， cloned into the expression vector pPIC9K，and transformed into Pichia pastoris GSl15． The phenotype His M ut for high—copy positive strainswere screened outby MD． MM and YPD containingantibioticsG418． Asa result，seven genetically engineered bacteria were screened by methanol—inductionwhich could expresslysozymeactivity．Afterthefermentation，thefiltratewas collectedanddealtwithammonium sulfate，andthepreliminarypurificationoflysozymewasobtained bydialysis．Thefurtherpurification oflysozymewasdonethrough CM 52一celluiosecation exchange column，andtheelectrophoreticpurelysozymewasobtained．Theresultsshow