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一 种改良的乳酸菌活菌数快速测定方法 熊涛 ，王韵 ，曾哲灵 ，黄锦卿 ，刘美君 1(南 昌大学食 品科学与技术 国家重点实验室 ，江西 南 昌，330047) 2(新加坡淡马锡理工学院食 品科学与营养系，新加坡 ，529757) 摘 要 乳酸苗有多种计数方法，但对科研和生产急需的乳酸菌活菌数快速计数方法的研 究和报道很少 。文 中 通过对美蓝直接计数法与平板稀释法、高层琼脂法 、GB法 、血球计数板计数法 、特殊染色计数法、比浊计数法等 进行试验比照，特别是美蓝直接计数法与平板稀释法 的对 比试验，研 究出一种直接 、快速 、准确地测定乳酸菌活 菌总数 的美蓝直接计数法。 关键词 乳酸菌 ，活菌数 ，美蓝直接计数法 乳酸菌活菌数是研究和生产 中经常需要跟踪测 植物乳杆菌 (．Pfnn rMm)NCu116和嗜热链球 定的指标 ，其测定方法有平板稀释法、高层琼脂法、 菌 Ncu307(5． erm0p “s)，南 昌大学食 品科学与技 GB法 、血球计数板计数法 、特殊染色计数法 、比浊计 术国家重点实验室保藏 。 数法等…。这些方法 各有优缺点：平 板稀释计数法 1．2 设备、试剂和培养基 和GB法是经典的乳酸菌活菌计数法，但操作过程繁 1．2．1 设备 、材料 琐 ，培养时间长 ，不能及时反映菌体生长情况，在实际 生物显微镜 、载玻片 、18mm ×18mm盖玻片、酒 应用中受 到一定 限制 ；高层琼脂法 除了操作过程繁 精灯、移液枪等。 琐 ，培养时间长外 ，培养 出来 的菌落小而密，不易计 1．2．2 试剂 数 ；血球计数板计数法在使用后计数板不 易清洗 ，易 吕氏美蓝 ：(A液 ，次 甲基 蓝 0．6g、乙醇 (95％) 有残留物 ，影响观察和计数结果 ；甲苯胺蓝特殊染色 30mL；B液 ，K0H0．Olg，蒸馏水 1o0mL；分别配制 计数法不能区分细胞死活；比浊计数法误差很大 ，其 A、B液 ，混匀 ，静置 0．5h，过滤 ，静置 24h后备用 。 计数结果受培养基成分 、代谢产物的影响很大。 1．2．3 培养基 美蓝是一种无毒性的染料 ，它 的氧化型呈蓝色 ， MRs培养基 ：蛋白胨 l％、牛 肉膏 l％、葡萄糖 还原型呈无色 。本研究发现用美蓝对乳酸菌的活 3％、乙酸钠 0．5％、酵母膏0．5％、柠檬酸二铵 0．2％、 细胞进行染色时，由于活细胞的新 陈代谢作用 ，细胞 K2HP04O．2％、MgSO40．02％、Tween800．1％。(pH 内具有较强的还原能力 ，可使美蓝由蓝色的氧化型转 6．5、12l℃、30min灭菌)。 变为无色的还原性。实验证实 ，具有还原能力的乳酸 平板计数培养基：在 MRS培养基基础上再加琼 菌活细胞是无色的，而代谢作用微弱的衰老细胞呈淡 脂 1．5％ 一2％。 蓝色 ，死细胞则为深蓝色 ，通过美蓝对细胞染色可直 GB法 中乳酸菌计数培养基：改 良TJA培养基 接进行乳酸菌的死细胞和活细胞鉴别和计数。 (改 良番茄汁琼脂培养基)。 本研究用美蓝染色并采用直接镜检计数 ，克服了