多重实时荧光定量聚合酶链反应检测携带耐药基因及肠毒素A基因的金黄色葡萄球菌.pdfVIP

疾病监测 年 月 日第 卷第 期 , . ,, . , .? ◇技术与方法◇ 多重实时荧光定量聚合酶链反应检测携带耐药 基因及肠毒素 基因的金黄色葡萄球菌 王娉,胡明,杨海荣,袁飞,赵勇胜,赵贵明,陈颖 摘要: 目的 建立一种快速鉴定携带耐药基因和肠毒素 基因的金黄色葡萄球菌的方法。方法 根据金黄色葡 萄球菌耐热核酸酶基因 、甲氧西林耐药基因 和肠毒素 基因 的序列,设计特异性的引物和不同荧光素 标记的 探针,通过反应体系和反应条件的优化,建立了能同时检测鉴定耐甲氧西林和产肠毒素 的金黄色 葡萄球菌的多重荧光方法。结果 该方法特异性好,可在同一个反应体系中同时检测金黄色葡萄球菌 的 种基因成分,检测效率高。灵敏度可以达到 × ~ 。结论 该方法可用于食品样品的检测和流行病学 分离株的快速鉴定。 关键词: 多重实时荧光定量聚合酶链反应;金黄色葡萄球菌; 基因; 基因; 基因 中图分类号:文献标识码: 文章编号:? ?? . , Ⅳ ,日 , 日 ,, 黝 ?, . ?,讯 .. . : . : .. : ? ?.... , ? . , . ×。 / .. : ? ; ; ; ; . . . .. 金黄色葡萄球菌 是引起 酶链反应 及杂交探针等为主的快速检测的现 院内感染和食物中毒最常见的病原菌之一。抗生 代方法 一 。目前,对金黄色葡萄球菌的检测 素的广泛使用使耐药菌株尤其是耐甲氧西林的金 主要集中在两个系列基因的检测即甲氧西林耐药基 黄色葡萄球菌大量涌现,使其成为与艾滋病、乙型 因的检测和产致病性毒素基因的检测 。本研究 病毒性肝炎并列的世界三大感染顽疾 。因此, 选取金黄色葡萄球菌最常引起食物中毒的肠毒素基 如何应用快速准确的检测方法,对于诊断金黄色葡 因 、甲氧西林耐药基因和金黄色葡萄球菌的耐热核 萄球菌引起的感染或中毒具有重要意义。传统的 酸酶基因,建立了多重实时荧光定量聚合酶链反应 检测方法包括分离培养、形态学观察及一系列生理 ?生化特性鉴定通常需要 ~ 天,且一般只能进行定 ,的检测方法,可同时检测耐甲氧西 性不能进行定量 。随着技术的广泛应用,对 林的及金黄色葡萄球菌和产肠毒素 的金黄色葡萄 金黄色葡萄球菌的检测也从传统方法过渡到以聚合 球菌,并初步验证了该方法的特异性和灵敏度,为该 方法的进一步应用奠定了基础。 基金项目:科技支撑计划项目.,,材料与方法 作者单位:中国检验检疫科学研究院,北京 作者简介:王娉,女,北京市人,博士后,主要从事食源性病原微生物 . 材料 的研究工作 通信作者:陈颖, : ? ,:. . .. 实验菌株 金黄色葡萄球菌、 收稿日期: ? ? 、 购自 菌种保藏中心; . . ‘ : . ..? .. . 疾病监测】年 月 日第 卷第 期 , . , , . , . 金黄色葡萄球菌食品分离株 、 、 、 生物分析仪 安捷伦科技公司 。 . 方法、 ,鼠伤寒沙门菌 ,甲型副伤寒沙 门菌 ,肠炎沙门菌 ,单增李斯特菌 . . 的提取 实验菌株经 ℃ 纯培,副溶血弧菌 ,志贺菌 ,表皮葡萄 养后用天根基因组提取试剂盒提取基因组,具 球菌,藤黄微球菌,松鼠葡萄球菌 体操作按照说明书进行。,小肠结肠炎耶尔森 均来源于中国验检 . . 重组质粒的制备 目的基因的扩增,以 检疫科学研究院食品安全微生物菌种保藏管理 菌株 、、基因组 中心。 为模板,应用设计的引物分别对 、 、 . . 引物及探针 根据 上公布的金黄 基因进行扩增。反应体系如下: 色葡萄球菌耐热核酸酶基因 基因、甲氧西林耐 含 . ,三磷酸脱氧核糖核酸 各 . /. ,/ 药基因 基因、肠毒素 基因基因序列, 分别设计特异的引物探针, 基因 端用标 . ,上下游引物 / 各 .,模 记, 端标记 、 基因端用标记, 端 板 .,加 至。循环反应参数 标记 、 基因 端用 标记, 端标记 为: ℃预变性 后, ℃变性 , 【表 。引物探针由上海生工公司合成。 ,延伸; 个循环;循环完成后, 充分延伸, ℃保存。扩增产物用 %琼脂糖 表 引物及探针凝胶电泳检测。纯化产物,获得、 、 基因的扩增片段。目的片段与载体的连接,分 别将目的基因片段与 一 连接,在的连接反应体系中,包括连接 , 一 ,产物 ,用无菌水补足至, 轻轻混匀, ℃ 过夜连接。重组质粒的转化, 取上述连接产物转入感受态细胞 中 具 体操作按照说明书进行 。转化后的感受态细胞涂 布于含 ? /的筛选平板, ℃过夜 培养,同时设定未转化的菌作为阴性对照。重 组质粒的鉴定,挑取经 . / 抗性筛 选出的白色转化菌落,于脑心浸