pIRES-PML-RARα重组载体的构建和表达研究.pdfVIP

沈阳医学院学报 JournalofShenyangMedicalCollege 第 15卷 第2期 2013年6月 ·69 · pIRES—PML—RARa重组载体的构建和表达研究 胡刚 ，岑东芝 ，杨力建 ，陈少华 ，周羽蛀。，李扬秋 (1．广东省惠东县人民医院内一科，广东 惠东 516300；2．暨南大学医学院血液病研究所；3．暨南大学医学院生物化学教研室；4．暨 南大学再生医学教育部重点实验室) [摘要]目的：采用不同长度的PML—RARc~融合基 因片段与 pIRES质粒构建真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表 达。方法 ：利用逆转录多聚酶链反应 (reversetranscriptionpolymerasechainreaction，RT—PCR)从 NB4细胞的RNA中分别 扩增出包含 PML—RARc~基因融合点的长度为245bp和384bp的基因片段，并将不同长度的基 因片段分别克隆到pIRES质 粒中，通过酶切和测序验证重组质粒的正确性。将重组质粒转染K562细胞，通过 RT—PCR和实时荧光定量PCR检测该质 粒在真核细胞中的转录。结果：NheI／M／uI双酶切证明重组质粒中含有相应大小的PML—RARa融合基因片段，测序结 果证明重组质粒中插入片段的碱基序列均完全正确。将构建的pIRES—PML-RARc~质粒转染K562细胞后经RT—PCR和实时 荧光定量PCR鉴定表明，插入到重组质粒中的PML—RARa基因能够在真核细胞中进行正常转录。结论：成功构建了含有 不同长度的PML．RARa基因的真核表达载体，该载体能够在真核细胞 中正常转录，为研发 DNA疫苗用于治疗急性早幼粒 细胞白血病提供重要资料。 [关键词]PML—RARc~融合基 因；急性早幼粒细胞白血病；DNA疫苗 [中图分类号]R733．71 [文献标识码]A [文章编号]1008—2344(2013)02—0069—04 doi：10．3969／j．issn．1008—2344．2013．02．002 Studyon Construction andExpression oftheEukaryoticCoexpression PlasmidContainingPM L-RARc~ HUGang ，CENDongzhi，YANGLijian，CHENShaohua，ZHOUYubing，LIYangqiu (1．DepartmentofInternalMedicine，ThePeople’SHospitalofHuidong，Huidong516300，China；2．InstituteofHematology，MedicalCollegeofJi— BallUniversity；3．DepartmentofBiochemistry，MedicalCollegeof3inanUniversity；4．KeyLaboratory forRegenerativeMedicineofMinistry ofEdu— cation，JinanUniversity) [Abstract]Objective：ToconstructaeukaryoticcoexpressionplasmidcontainingPML—RARergenebyusingPML—RARergene segmentswithdifferentlength．Methods：PML—RARafusiongenesegmentswithdifferentlengthwereamplifiedfrom NB4 cellline byreversetranscriptionpolymerasechainreaction (RT—PCR)．BothPCRproductswereclonedintopIRESplasmidtOconstructare- combinantplasmidpIRES—PML-RARa．Therecombinantplasmidswereidentifiedbydoubleenzymecuttingandsequenceanalyzing． AfterbeingtransfectedintoK562cells，RT·PCR andreal—timefluorescencequantitativePCR wereusedtodetectthetranscriptionof theserecombinnatplasmidsineukaryoficcells．Reslllts：Restrictionn