1株脂肪酶产生菌的筛选鉴定及其脂肪酶基因的克隆表达.pdfVIP

第 45卷第 3期 华 中师范大学学报 (自然科学版) V01．45 NO．3 2O11年 9月 JOuRNAIOF HUAZHONG NORMAIUNIVERSITY(Nat．Sci．) Sept．20l1 文章 编号 ：l0001190(2011)03—044406 1株脂肪酶产生菌的筛选鉴定及其 脂肪酶基因的克隆表达 刘 义，孟丽君 ，楼 梦 ，姚汉超 ，刘修齐， 刘小兰，馀可瀚 ，李 娜 ，刘德立 (华 中师范大学 生命科学学 院 遗传调控与整合生物学重点实验室 ，武汉 430079) 摘 要 ：从武汉市郊 蓖麻地土壤 中分离到 1株产脂肪酶菌株 ，结合形态观察和生理生化鉴定 ，扩增 16SrDNA并测序 ，运用 Blast比对构建 了进化树 ，发现该菌与粘质沙雷 氏菌 (Serratiamarcescens) 的同源性高达 99 ，初步鉴定该菌属于沙雷 氏菌属 (Serratia)，命名为 Serratiasp．H I5．克隆了 脂肪酶基 因HS-Lip5，该基 因全长 1842bp，编码氨基酸 614个 ．序列经 Blast比对分析发现与 SerratiamarcescensSM6的 lipA序列的同源性高达 98 ，经氨基酸序列初步分析 ，发现 Serratia sp．HSL5的氨基酸序列包含脂肪酶共有序列一 X一 X— ．将 HS-Lip5基 因克隆到表达载体pET 28a，并在 E．coli中获得 了表达． 关键词 ：菌株筛选 ；粘质沙雷 氏菌 ；脂肪酶 ；克隆表达 中图分类号 ：Q8l9 文献标识码 ：A 脂 肪 酶 (Triacylglycerolacylhydro1ases，EC 研究酶的功能，包括底物识别和催化功能[5．脂肪 3．1．1．3)是广泛存在于动物、植物和微生物体内的 酶在不同物种 中序列差异很大 ，但都含有一些保守 水解酶 ，它对于多种底 物 同时具 有水解 和转酯活 区域一G—X—S—G—X一]．粘质沙雷 氏菌是 1株能产脂 性 ，水解三丁酸甘油 酯生成脂肪酸和甘油 ，它在食 肪酶的菌株 ]．本文利用分子生物学技术 ，从 自然 品工业 、造纸工业 、去垢剂 、有机合成、生物转化 与 界中筛选 出的野生型粘质沙雷 氏菌 中克隆出脂肪 催化等方面都有广泛应用 ，具有很 高 的工业价 酶基 因，对其进行氨基酸序列 比对分析 ，为研究粘 值 ¨】．由于微生物脂肪酶种类多，便于进行工业化 质沙雷氏菌的结构和功能的关系提供依据 ，从而对 生产和获取高纯度制剂 ，在应用上比动植物脂肪酶 粘质沙雷氏菌脂肪酶基因进行分子改造 ，改善酶的 有更广的pH范围、更宽的作用温度范围和对底物 性质，提高酶 的稳定性 ，并在 同源或异源宿主中进 的专一性 ，所 以在理论研究和实际应用中都有着更 行高效分泌表达提供理论基础． 重要 的作用 j．但从 自然界中筛选到的产脂肪酶野 1 材料与方法 生型菌株，其脂肪酶基因往往受到本身宿主菌 的严 格调控 ，表达的脂肪酶产量较低 ，很难满足脂肪酶 1．1 菌株 的规模化工业生产．通过借助分子 生物学技术 ，从 菌株分离土样采 自武汉市郊蓖麻土壤． 野生菌 中克隆出脂肪酶基因，并进行 同源或异源重 1．2 培养基及试剂 组表达 ，提高产酶量 ，从而可 以更好地应用于工业 富集 培 养 基 (g／I)：酵 母 膏 0．2，NazHP() 化生产 ． 3．5，K2HPO 1．5，MgSO4 ·7H2O 0．5，NaC1