肾上腺切除的肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组的研究.pdfVIP

维普资讯 中国中医基础医学杂志 2008年第 14卷第 5期 350 ChineseJoumalofBasicMedicineinTraditionalChineseMedicine 2008．Vo1．14．No．5 【实验研究】 肾上腺切除的肾阳虚大 鼠肝线粒体蛋 白质组的研究 卢德赵 ，沃兴德 ，施孟如 ，沃立科 ，唐利华 ，李 毅 (1．北京中医药大学 基础医学院，北京 100029；2．浙江中医药大学 生命科学学院，浙江 杭州 310053) 关键词 ：肾阳虚；线粒体 ；蛋 白质组 ；能量代谢 中图分类号 ：Q493．8；R2．031 文献标识码 ：B 文章编号：1006．3250(2008)05．0350．04 肾在中医脏腑学说 中 占有重要地位，其功能广 正常组大鼠表现如常。 泛 、作用特殊，有主宰生命之概念，故历代 医学家称 1．2 肝线粒体蛋 白质的提取与纯化 “肾为先天之本”、“生命之根”。肾阳虚证是指 由于 切除肾上腺后第 6天断头处死肾阳虚组大 鼠与 肾阳虚衰 、温煦失职 、气化失权所表现的一类虚寒证 正常对 照组大 鼠，取肝脏用 0．25mol／L蔗糖冲洗 2 候。许多学者认为，肾阳虚与神经．内分泌紊乱有 次，在 4℃ 1／10(w／v)体积 pH7．4的MSHE缓冲液 关，肾阳虚病人垂体．肾上腺皮质功能降低和垂体． (0．22mol／L 甘 露 醇 ，0．07mol／L蔗 糖，0．5mmol／L 甲状腺功能降低…，临床主要表现为腰膝酸软而痈， EGTA，0．1％ 牛血清 白蛋 白，2mmol／LHepes／KOH)中 畏寒肢冷；头晕 目眩，精神委靡 ，面色 咣 白，舌淡苔 匀浆，600g离心 5min后取上清，再经 10300g离心 白，脉沉细。通过切 除肾上腺所造成 肾阳虚动物模 10min，沉淀 物重 悬于 5mlMSHE，加到 20rIll含 30％ 型在 肾阳虚的研究 中已被广泛使用 ，此方法所造 Percoll的纯化 液 中 (225mmol／L甘 露 醇，1mmol／L 成的实验动物均表现为畏寒肢冷、拱背耸毛、便溏等 EGTA，25mmol／LHepes，0．1％牛血 清 白蛋 白)，于 症。结合临床 肾阳虚病人及动物模型的表现 ，不难 95000g离心30min，收集密度 1．052～1．075g／ml之 间 看 出肾阳虚特征之一是能量代谢障碍。肝脏是物质 的悬液，加入 40mlMSHE，于 6300g离心 10min以去 代谢的重要器官，与能量代谢 直接相关 的细胞器是 除 Percoll。并用 150mmol／LKC1和 MSHE分别洗涤2 线粒体 ，线粒体通过物质代谢和氧化磷酸化作用为 次，加入 1m1裂解液 (30mmol／LTris，8mol／L尿素，4％ 细胞的各项活动提供能量。因此，通过检测肾阳虚 CHAPS，pH8．5)，4℃孵育2h。置冰上超声，超声后用 动物肝线粒体蛋 白质组的变化，就可以很好地解释 12000g离心 30min，取上 清用 2．Dcleanupkit去杂 中医肾阳虚的本质。本实验利用凝胶 内差异显示电 质，并用 2．D定量试剂盒测定蛋 白质浓度 ，分装成 泳技术 (DifierentialIn．gelElectrophoresis，DIGE)建立 10x／g／L，置 一80℃保存 。 正常大鼠、肾上腺切 除的肾阳虚模型大 鼠肝线粒体 1．3 荧光标记蛋 白质 蛋 白质双 向电泳图谱 ，并进行差异蛋 白质组分析，从 将CyDye(Cy2、Cy3和 Cv5)从 一20℃取 出，室温 能量代谢相关蛋 白质水平来探讨 肾阳虚的本质，寻