同型半胱氨酸转甲基酶的制备及纯化.pdfVIP

广东医学 2011年1o月第32卷第19期 GuangdongMedicalJournal ．2u !o1． !N0． ．2505． 同型半胱氨酸转 甲基酶的制备及纯化 杨一芬，王天菊，卿之驹 中南大学湘雅二医院检验科(长沙410011) 【摘要】 目的 建立同型半胱氨酸转甲基酶(BHMT)的制备及纯化方法，为临床应用提供基础。方法 采 用大肠埃希茵表达体系获得 BHMT蛋白，然后应用SephadexCL一6B、DEAESepharoseFastFlow、SephadexG一75 层析柱纯化BttMT，并行Westernblot验证。分别用商品化同型半胱氨酸试剂盒和提纯的BHMT测定20份血清的 同型半胱氨酸浓度，初步判断纯化的BHMT活性。结果 (1)BHMT在大肠埃希茵体系中成功表达，并经Sepha- dexCL一6B、DEAESepharoseFastFlow、SephadexG一75层析柱纯化后在Westernblot上显示为单一条带，分子量为 45kD。(2)采用纯化的BHMT检测20例标本，与商品化试剂盒检测结果差异无统计学意义 [(17．19±4．10) i~mol／L (16．48±3．48)Ixmol／L，P0．05]，且结果呈高度正相关(r=0．92，P0．05)。结论 建立的BHMT的 制备及纯化方法切实可行 ，有望应用于同型半胱氨酸浓度的检测。 【关键词】 同型半胱氨酸转 甲基酶；同型半胱氨酸；层析法 同型半胱氨酸 (homocysteine，Hcy)即2一氨基 一4 AN／11XiCell电泳仪 (美国Bio—Rad)，鼎 国py一120 巯基丁酸，结构式为 HSCHCHCHC(NH)CO：H…，在 水平脱色摇床 (北京鼎国生物技术有限责任公司)，红 1932年由DuVigneaud等在研究有关硫的代谢时首次 外快捷加热过胶机 (杭州五环办公设备技术有 限公 合成。研究普遍认为，高同型半胱氨酸血症是心血管 司)，匀浆仪 (上海浦江分析仪器厂)，NovaBlot转印仪 疾病的独立危险因素。临床上i贝4定 Hcy采用循环酶 (PharmaciaBiotech)。 法 ，同型半胱氨酸转 甲基酶 (homocysteinemethyltrans— 1．3 实验方法 ferase，BHMT)是测定的关键酶之一，因其特有的高灵 1．3．1 BHMT的制备 将含有 BHMT外源性基 因的 敏度和特异性而被广泛地应用到临床心血管疾病和相 大肠埃希菌接种至血平板，37cI=培养过夜后转接种到 关疾病的诊断中。自1966年 Garrow等首次克隆出人 含氨苄青霉素的LB培养液中，37~C在摇床上培养至对 类的BHMT ，目前国际上已有商品化的BHMT出售， 数中期 ，加入 IPTG诱导 8h之后离心弃上清留沉淀。 其中酶的组分往往来 自于多步的分离纯化。而我国 目 用缓冲液混匀沉淀后用电动搅拌机 5000r／min以破 前鲜见相关报道。因此制备活力高、稳定性好、专一性 坏细菌，冰浴匀浆2min，15000g离心 15min，弃沉淀 强的BHMT，对于我国心血管疾病的诊断有着重要的 取上清 。 临床意义。2008年9月至2010年2月，我们对 BHMT 1．3．2 BHMT的纯化 将上清液依次经过 Sephadex 的制备及纯化进行了探讨。现报告如下。 CL一6B层析柱、DEAESepharoseFastFlow层析柱 、 1 材料与方法 SephadexG一75层析柱之后得到提纯的BHMT。 1．3．3 BHMT的分子量鉴定 用 Western blot验证层 1．1 主要试剂 菌种[质粒PQE30，菌种来源于E．CO- 析后的蛋白峰是否含有 BHMT，根据 Marker的条带大 liBL21(DE3)，实验室一70cI=保存，湖南远泰生物技术 概判断其 kD值。 有限公司提供]，LB肉汤 (广东环凯微生物科技有限公