猪瘟病毒通用型RT—LAMP方法的建立与应用.pdfVIP

畜牧兽医 试验综逋 猪瘟病毒通用型RT—LAMP方法的建立与应用 兰德松，闰明媚，赵凤菊，顾贵波 (辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁 沈阳 110164) 中图分类号 $854．43 文献标识码 A 文章编号 1672—9692(2013)04—0050—04 1一……一一…………………………一……一……………………………………一……一…一…一≈ _’! }0： 摘【 要】本研究根据猪瘟病毒(CSFV)基因组的NS5B基因片段，设计了4条针对NS5B基因 6个位点的RT-LAMP扩增引物，建立的方法能特异性地检测出CSFV，而PRV、PPV、PRRSV、PCV、 FMDV等病毒扩增结果均为阴性；该方法与猪瘟荧光RT-PCR方法相比，特异性无明显差异，敏 感性高10倍；另外，该方法耗时短，只需1h，操作简单，不需要PCR仪等特殊仪器，扩增产物 可通过 肉眼观察、或加入荧光染料在紫外灯下观察特异性荧光、也可通过凝胶电泳检测，因 此适合从临床病料中快速准确检测出猪瘟病毒感染情况，适合推广应用于基层和野外现场。 关【键词】猪瘟病毒；RT-LAMP；快速诊断 } l 一 一 一 … 一 一 一 一 … 一 一 一 … … … … … … 一 一 一 … 一 … … … … … … … … … … 一 … 一 一 一 一 一 一 一 … … … … … … 一 … … … 一 猪瘟是 由猪瘟病毒 (CSFV)感染猪和野猪引 特殊设备、成本低廉等诸多优点，该技术 自2000 起感染动物发病并死亡的高度传染性疾病，为我 年由日本的Notomi等发明以来，被广泛应用于病 国规定的四大强制免疫病种之一，我国将其列为 原微生物 的检测 。LAMP反应结果非常易于观 一 类动物疫病，世界动物卫生组织将其列为A类 察，反应过程中产生的大量焦磷酸盐使反应液呈 传染病n。该病在我国流行 已经有近 80年 的历 浑浊，肉眼即能观察到，另外，利用浊度仪能更 史，对养猪业危害严重。近年来，猪瘟流行又呈 精确地观察浑浊程度；也可在反应液中加入荧光 现 出一些新的特 点：发病 日龄小，大多见于9O 染料，在紫外灯下阳性样品会发出明显的绿色荧 日龄以下；呈散发性流行，无明显季节性；持续 光；还可应用 电泳观察LAMP特征性条带或用酶 感染普遍存在，临床症状大多为非典型的温和型 切进行鉴定口]。为此 ，本试验建立了快速 、灵 猪瘟，尤其是低毒力病毒在感染猪体内持续存在 敏 、特 异 且 无 需特 殊 仪 器 的猪 瘟 通 用 型 并向外排毒，导致猪场持续感染；母猪隐性感染 RT—LAMP检测方法，以方便基层现场检测需要。 和带毒母猪综合症普遍存在，这些因素导致了猪 1 材料和方法 瘟不易控制和净化口。 1．1 病毒株和待检材料 猪瘟兔化弱毒疫苗株 目前常用的血清学检测技术，如猪瘟正向间 (HCLV)、猪伪狂犬病病毒、猪蓝耳病疫苗株、 接血凝试验和ELISA试验不能区分免疫抗体与感 猪O型 口蹄疫疫苗株、猪细小病毒和猪圆环病毒 染抗体，病原学检测技术，如常规PCR技术、实 为本中心保存；待检材料为辽宁省部分地区猪场 时荧光PCR技术和基因芯片技术 目前虽然能够较 或门诊送检疑似猪瘟病料。 好检测CSFV，但均需要昂贵的仪器 ，并且操作 1．2 引物设计与合成 参照NCBI上发表 的42 复杂，另外，经典的病毒分离技术耗时更长，并 株CSFV及20株BVDV全基因组序列，利用生物 且需要实验室细胞培养等特殊条件，这些技术无 学软件DNAStar进行序列 比对分析 ，最终选取 法满足基层和大部分规模场现场快速检测需求。 NS5B基因作为靶序列，利用LAMP在线设计软 而反转录环介导等温扩增 (RT—LAMP)技术具有 件PrimerExplor