PCR定量技术在医学上的应用及其方法学评估.pdfVIP

医学检验与临床 2033年第 24卷第 1期 MedicalLaboratoryScienceandClinics，2013，Vo124，No．1 。49 · PCR定量技术在医学上的应用及其方法学评估 梁勇彪 (南宁市第二人民医院检验科，广西南宁 530031) PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片 与PCR产物形成完全同步。反应每复制一个特异 段 ，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样 核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光 本 中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量， 信号的释放。荧光信号的强弱与PCR产物的量成 而荧光定量 PCR技术则是为了测定样本 中特异的 正比_2】。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异 PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 信号，无需进行有效和无效信号分离，实现了仪 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含 器实时检测，为新的定量原理创造了条件 】。常用 量 、实验样本中某一特 定的mRNA的含量等。基 的荧光材料包括水解探针或Taqman探针、发夹结 因定量检测已经成为研究遗传性疾病、感染性疾 构探针 (分子信标、seorpionTM、sunriseTM引物、 病 以及某些易感基因引起的疾病 的重要手段。 目 LuXTM引物 )、杂交探针和 SYBRGreenI等 J，可 前临床医学应用最为广泛的是以PCR为基础的基 根据实验条件选用。目前它作为一个有效的实验 因定量方法 …。PCR扩增技术，又称无细胞分子 方法，已被广泛应用于分子生物学研究的各个领 克隆系统或体外酶促基因扩增法，以PCR为基础 域，如基因分型、基因表达、病毒载量分析和基 的基因定量方是通过测定反应产物的量来计算初 因定量等 。 始模板的量 ，从而实现基因定量分析。实验的成 1．1．2SYBR荧光染料 ：在PCR反应体系中， 功受多方面因素的影响，例如模板的浓度和纯度， 加入过量SYBR荧光染料 ，SYBR荧光染料特异性 反应体系的设计 ，产物的竞争，反应循环数等等。 地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链 定量检测大多数是通过测定反应产物的量来计算 中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而 初始模板的量。 保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 1．2方法学评价 ：实时荧光定量 PCR法，具有 1实时荧光定量 PCR (FO—PCR) 优点A：检测速度快，线性范围较大，不同浓度的 起始模板较易检测，且实时不易污染。实现了批 1．1原理 ：是指在常规 PCR基础上添加 了一 量检测，，并节省人力物力 j。B：重复性好、定量 条标记了两个荧光基团的探针，利用荧光信号积 准确，特异性好、灵敏度高。C：采用非荧光淬灭 累实时监测整个 PCR进程 ，最后通过标准 曲线 基团，使得淬灭效率更高，降低了本底信号的强度， 对未知模板进行定量的方法 。荧光定量 PCR所 探针还可连接有修饰基团，可以将探针的Tm值大 使用的荧光化学可分为两种 ：荧光探针和荧光染 幅提高，大大加强了定量 PCR反应过程中的特异 料 。 性 。缺点有 ：目前可用的荧光染料很少，每管里 1．1．1TaqMan荧光探针 ：PCR扩增时在加入 最多同时进行 4个位点的扩增，检测通量有限，因 一 对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该 而不适合用于大基因。对初始