肌动蛋白结合脂筏促进巨噬细胞摄入土拉弗朗西斯菌.pdfVIP

微生物学杂志 年 月第 卷第 期. 。. 肌动蛋白结合脂筏促进巨噬细胞摄入土拉弗朗西斯菌 潘 欣,曾思良,蔡家麟,吴鉴今,杨 光,黄通来 第二军医大学微生物学教研室,上海 摘 要 观察土拉弗朗西斯茵借助脂筏以肌动蛋白为动力被鼠巨噬细胞摄入的过程。细胞胆固醇用菲 律平Ⅲ染色,结合神经节苷酯的霍乱毒素 亚基用键合了的兔抗霍乱毒素 亚基二抗显色; 肌动蛋白用键合了的鬼笔环肽显色。免疫荧光显微镜观察到脂筏成分中的胆固醇、神经节苷酯 均可与细菌共定位;胆固醇可与肌动蛋白共定位。随着感染时间的延长,细茵可离开脂筏。离开脂筏的 细茵囊泡可与肌动蛋白共定位。这些发现提示肌动蛋白与脂筏结合,在弗朗西斯菌早期进入巨噬细胞期间发 挥重要作用。 关键词 巨噬细胞;土拉弗朗西斯茵;脂筏;胆固醇;肌动蛋白 中图分类号 文献标识码文章编号 ? ? ? ,? ,? , , , .., . . . ., . ?,?. . .?,?, . , .. . ; ; ; ;土拉弗朗西斯菌 最早 亚种 型 、中亚细亚 于年在美国加利福尼亚的图莱里县 亚种和新凶手亚种。其他从环境中检暴发 的鼠疫 样疾 病 的地 松 鼠测到的亚种尚未成功分离培养。 型菌株 高致 中分离出来?。 世纪 年代和 年 病性 几乎专属于北美,而 型分布在整个北半 代由于大规模的水路运输,该病在欧洲、前苏联和 球温带地区,相对弱毒,未治疗的皮肤感染死亡率 美国流行,因该病最常见于野兔中,也称野兔热 低于 . % 。我国自年首次在内蒙通辽 。土拉弗朗西斯菌包括 个确认 地区从黄鼠体内首次分出土拉弗朗西斯菌后,在 的亚种:土拉热亚种 型 、全北区 黑龙江、青海、西藏、新疆等地又从人、野兔、硬蜱 基金项目:国家自然科学基金资助课题作者简介:潘欣 女,博士,副教授,硕士生导师。从事胞内致病微生物研究。: .收稿日期: ;修回日期: 微 生 物 学 杂 志 中相继分离出该菌。西藏阿里地区已证实为土拉 % 中培养至指定时间点。 弗朗西斯菌病的自然疫源地 。土拉弗朗西斯 . . 免疫荧光染色 . 接种于培养皿 菌为革兰阴性、不运动、不形成芽胞的需氧球杆 的无菌盖玻片上,细胞感染 为 的 . 菌,该菌采取有效的方式侵入宿主细胞并在细胞 ,在给定时间内用 %多聚甲醛固定 , 内增殖,在侵入以及在宿主细胞内运输内化期间, 洗,用含 . % 一 的透化 曾观察到巨噬细胞膜微结构域中的窖蛋白涉及土,洗,用汀 信号增强剂. 拉弗朗西斯菌的早期入侵 。最近的研究发现 封闭 ,成为固定片。用将霍乱毒 土拉弗朗西斯菌感染巨噬细胞 ~ ,可查 素 亚基 , 稀释 见脂筏相关成分如胆固醇和神经节苷脂涉 至/ ,于 ℃与固定片孵育 ,及土拉弗朗西斯菌侵入胞内,肌动蛋白与胆固醇 洗。能与脂筏中的神经节苷脂特异结 结合为巨噬细胞摄入细菌提供动力;感染 合,触发胞膜窖介导 ? 的毒素内 以后,脂筏难以查见,但可观察到肌动蛋白富集在 化 。用将键合了 的兔抗霍乱毒 细菌周围,可能与细菌在胞内运动或胞间感染 素 亚基 按 :稀释,室温显 有关。 色。洗后,过一遍双蒸水,晾干。盖玻 片用抗褪色金牌介质 在载玻片上装 材料与方法 片。 . 接种于培养皿的无菌盖玻片上,细 . 材料 胞感染为 的 ?,培养皿中同时 . . 菌株、细胞系和质粒 土拉弗朗西斯菌全 加入终浓度为/ 菲律平 Ⅲ 北区亚种 . .。菲律平Ⅲ是一种结合胆固醇的制剂, 插入细胞膜后显示蓝色荧光 。感染 后 ,以下简称 及表达绿色荧光蛋白 制成固定片。键合了 的鬼笔环肽 的 .菌株为本室保存 。表达 磷酸 甘露糖受体的 . 细胞购于 。 按 :稀释,于室温 与固定片孵育 。键合了 的鬼笔 . . 培养条件 细菌用含有的巧克力Ⅱ琼脂平板于 ℃培养 环肽可与细胞肌动蛋白结合显示红色荧光。 。完全细胞培养基为中补充 洗后,过一遍双蒸水,晾干,装片。带有电动 轴 的 荧光显微镜置于隔离器中¨引,每 了 %胎牛血清,未进行热灭活 。活 个荧光通道在 轴取 叠。使用 、和 菌操作在生物安全三级实验室完成 。 德克萨斯红滤光片。用 .. 方法 软件融合荧光通道。数据通过生物安全三级实验 . . 土拉弗朗西斯茵感染巨噬细胞 用 一 室内网传出。 次性接种环挑取数个土拉弗朗西斯菌克 隆悬浮于含 %的 中。 / 结果与分析 离心 。细菌沉淀用含 %的. 脂筏结合肌动蛋白参与的早期 洗 次,再重悬于含 %的 中。用湖/克隆形成单位标准曲线将感染复数调整为 入侵 脂筏是膜脂质双层内富含鞘磷脂、鞘糖脂、。 . 细胞接种于细胞培养皿中培养 胆固醇、 一锚 固蛋 白和. 等 的微 。细胞用暖