人成骨肉瘤细胞系MG-63“Holoclone”样单克隆的分离及其成骨分化程度的鉴定.pdfVIP

中国实验诊断学 2010年 11月 第 l4卷 第 11期 ·_ 。— — 1769 ———·— 文章编号：1007—4287(2010)11—1769—03 人成骨肉瘤细胞系 MG一63“Holoclone样单克隆的 分离及其成骨分化程度的鉴定 孙树东 ，娄 楠 ，王 岩 ，赵建武 (1．吉林大学第二医院 骨科，吉林 长春 130041；2．吉林大学中 日联谊医院骨科； 3．吉林大学 中 日联谊医院基 因诊疗 中心) 骨 肉瘤无论从临床角度还是分子生物学角度来 1．3．2 细胞增殖率测定 用96：~L板接种细胞数为 讲都是一个异质性的肿瘤，而其一直就采用间充质 103／~L，连续计数 7d，绘制生长 曲线。采用 Cell 的分化标准来进行分级。尽管 目前在医学研究和外 CountingKit一8(CCKS)分析骨肉瘤细胞增殖。每组取 科手术上都取得了长足的进步，但对于高危骨肉瘤 6个复孔，将培养板移人 C0孵箱 中，在 37℃，5％ 的死亡率仍然停滞在 30％到 50％，而如何针对其 co2及 95％湿度条件下，培养 24h。每孔加 CCK．8 近年来已有学者通过骨肉瘤 的研究，使用单细胞克 试剂 10 l，放人 co2孵箱 中孵育 2h，酶标仪波长 隆筛选 的方法，以图得到高侵袭，高致瘤 的细胞亚 450n／n，读取光密度 OD值。记录结果 (细胞 OD值 群。而我们采用先分离得到holoclone后通过多个成 = 细胞孔 OD值 一清零组 OD值)。以不同单克隆亚 骨细胞分化标志物的检测，得到高侵袭及高致瘤 的 系为横坐标，细胞增殖百分率(％)为纵坐标 (以0h 骨肉瘤细胞株 。并对这些骨肉瘤细胞株进行了一系 增值率作为 100％)，使用MicrosoftExcel软件绘制细 列的鉴定试验 。而通过观察我们发现能够形成 胞生长曲线。 “holoclone”的恶性肿瘤细胞是肿瘤 中的真正致瘤部 1．3．3 软琼脂集落形成试验 取37％保温的不同 分 ，而这些细胞株形成的克隆更小 ，具有很高 的克隆 密度的细胞悬液 9．4ml移人小烧杯 中，加入 50℃ 形成能力和更强的粘 附能力[1,23。其成骨分化标志 5％琼脂 0．6ml，迅速混匀 ，立即浇入铺有底层琼脂 物表达更趋近于未分化状态 。 (浓度为0．3％)的24孔培养板 中，每孔加 0．8ml， 1 材料和方法 置室温使琼脂凝 固，每孑L细胞数为 100，接种 14d 1．1 材料 后，计算克隆数，每个集落细胞数 ≥50时为 1个克 人成骨 肉瘤细胞 MG-63购 自ATCC。高糖 隆。 DMEM(H．DMEM)GibicoUSA优等胎牛血清 (FBS) 1．3．4 细胞周期检测 ①取传代生长 良好的对数 HycloneUSA胰酶 PromegaUSADMSO天佳生物科技 生长期细胞，0．25％胰酶消化收集细胞 。加入 4~C 有限公司 ChinaDEPC鼎 国生物科技有限公司 China 预冷的75％乙醇 固定 24h，预冷 PBS洗两次 ，1000 TrizolInvitrogenUSATaKa_RaRT-PCRKitTaKaRaJapan rpm离心 5min，调整细胞浓度为 1×106／mL。加入 Marker1500TakaraJapna TaqDNA聚合酶 TAKARA 0．5rnl碘化丙啶(50t~g／mL)，4℃避光染色 30min。 JapanCCk．8碧云天生物研究所 CHINA 流式细胞仪分析，在波长为 488nln、300mv氩离子 1．2 克隆筛选